山东省部分地区鸭养殖屠宰链中产气荚膜梭菌的分离鉴定及基因分型

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产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种重要的人畜共患病原微生物,不仅可以导致家禽的坏死性肠炎(NE),给养殖业造成巨大的经济损失,还能够引起人食物中毒等消化道疾病,给人的健康带来一定的威胁。随着抗生素的广泛使用,产气荚膜梭菌对抗生素的耐药性不断增强,多重耐药现象明显,严重影响了抗生素的临床治疗效果。家禽是产气荚膜梭菌的主要宿主,其屠宰加工过程中往往会被产气荚膜梭菌污染。虽然各国对不同宿主及食品中产气荚膜梭菌的流行状况开展了较为系统的研究,但关于家禽养殖屠宰链中产气荚膜梭菌的报道还相对匮乏,中国是世界上最大的肉鸭生产国,山东是养鸭大省,因此对山东地区鸭养殖及屠宰过程中产气荚膜梭菌的流行情况、血清型分布、耐药性以及遗传演化规律进行研究,不仅可以填补鸭源产气荚膜梭菌流行情况研究的空缺,为养殖场合理使用抗生素提供理论依据,同时对评估公共卫生和食品安全也具有重要意义。2018年12月至2019年6月,从潍坊地区某养殖屠宰一体化公司的肉鸭养殖屠宰链以及泰安、聊城、潍坊地区四个鸭场的鸭养殖阶段采集样品共计939份,经选择培养基分离培养后,用PCR扩增鉴定产气荚膜梭菌8种毒素基因,通过K-B纸片扩散法检测分离株对12种(10类)常用抗生素的耐药性,并利用多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)的方法确定部分分离株的基因型、了解不同地区不同来源的产气荚膜梭菌的遗传相关性。本研究939份样品中有498份(53.04%)被检测为产气荚膜梭菌阳性,其中养殖场样品阳性率为50.16%,屠宰场样品阳性率为58.86%。各养殖场鸭泄殖腔阳性率有所差异,其中无抗养殖场(聊城肉鸭场Farm 2)阳性率最高(72.5%),与其他养殖场相比差异显著(P<0.05),此外鸭养殖早期阶段产气荚膜梭菌阳性率相对较低(22.00%)。各屠宰环节样品的污染情况有所不同,其中脱毛环节样品阳性率最高(85%),是屠宰过程中胴体污染的风险点,消毒预冷后样品污染率(28.33%)显著低于其他环节(P<0.05),是切断屠宰链中产气荚膜梭菌传播的关键。PCR扩增结果显示,859株分离株均为A型产气荚膜梭菌,34.69%的分离株携带cpb2基因,0.93%的分离株携带cpe基因。药敏试验结果显示,78.79%的分离株存在多重耐药现象,43.27%的分离株对至少5类常用抗生素耐药;各养殖场分离株耐药情况有所差异,其中无抗养殖(聊城Farm 2)及发酵床养殖(潍坊Farm 4-2)的鸭群分离株多重耐药率分别为64.58%、67.44%,比传统养殖模式下的分离株多重耐药率低。多位点序列分型(MLST)结果表明,117个有代表性的分离株共分为74个序列类型(ST),其中以ST3最为常见(17.09%),是聊城种鸭场(Farm 3)和潍坊养殖场(Farm4)及屠宰场的流行型。85株养殖场分离株中,有30.59%被分为5个克隆复合物(CC),其中以CC1最为普遍,为聊城肉鸭场(Farm 2)的流行亚型,占养殖场检测菌株的15.29%。虽然所有分离株均为A型,但各地区养殖场及屠宰场分离株的遗传多样性差异较大,聊城、泰安和潍坊养殖场分离株的辛普森(Simpson)多样性指数分别为0.5941、0.9198和0.9627,屠宰场分离株的辛普森多样性指数为0.9023。部分泄殖腔分离株和养殖场环境分离菌分布在相同的ST或CC中,表明环境中的产气荚膜梭菌是鸭泄殖腔分离株的可能来源;相同基因型的分离株存在于养殖屠宰链的各个环节,表明鸭源产气荚膜梭菌存在从养殖场传播至屠宰场并沿着屠宰加工链自上游环节传播到下游环节污染产品的可能;部分鸭胴体及产品分离株和屠宰场环境分离株属于同一ST型或CC,表明屠宰场环境与胴体间可能存在交叉污染;部分人源和鸭源菌株被发现亲缘关系较近,提示产气荚膜梭菌可能通过食物链对人类构成潜在威胁。
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