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试验一:奶牛隐性乳房炎三种致病菌多重PCR检测方法的建立根据S.aureus NUC耐热基因、S.agalactiae 16S rRNA基因、P.aeruginosa ETA基因序列设计特异性引物。通过对PCR反应退火温度、模板比例、引物比例的优化调整,建立多重PCR最佳检测体系,并同时进行灵敏性和特异性试验。结果显示:该检测方法可以同时扩增出S.aureus 153 bp、S.agalactiae 270 bp和P.aeruginosa 375 bp的特异性片段以及细菌16S rRNA 1500 bp的通用片段,而对于对照组的芽孢杆菌、大肠杆菌、粪球菌、柠檬酸杆菌、不动杆菌、腐生葡萄球菌等只能扩增出1500 bp的通用片段;扩增基因的片段序列与Genbank上三种细菌对应的基因序列同源性均达99%,具有较强的特异性。经检测,该体系对增菌培养24 h的S.aureus、S.agalactiae、P.aeruginosa的最低灵敏度分别为4×104 cfu/mL、8×104 cfu/mL、1.5×106 cfu/mL,其对应的DNA浓度分别为5.97×10-2 ng/μL、6.68×10-22 ng/μL、5×10-22 ng/μL。试验二:牛乳中S.aureus、S.agalactiae、P.aeruginosa的两种检测方法比较为了比较建立的多重PCR与传统细菌分离鉴定方法在检测牛乳中S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的差异,分别对四川奶牛场送检的100份奶样（其中5份为正常奶样,35份为隐性乳房炎奶样,60份临床型乳房炎奶样）进行检测。结果显示:在60份临床型乳房炎奶样中,检出S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的奶样,采用细菌分离鉴定法分别有14份、14份、8份;而多重PCR方法分别为14份、13份、12份,两种的检出吻合率分别为100%、96.6%、93.3%。在35份隐性乳房炎奶样中,检出S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的奶样,采用细菌分离鉴定法分别有10份、20份、1份;而多重PCR分别为6份、19份、0份,检出吻合率分别为88.5%、97.1%、97.1%。在5份正常奶样中,两种方法均未检出细菌。在细菌分离鉴定法总体水平上检出S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的奶样分别有24份、34份、9份;其检出率为24%、34%、9%。而多重PCR检测法分别为20份、32份、12份;其检出率为20%、32%、12%。所有样品中S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的检出吻合率分别达96%、98%、97%。试验三:S.aureus、S.agalactiae、P.aeruginosa三种病原菌感染对奶牛隐性乳房炎乳汁成份的影响为了探讨S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa感染对奶牛隐性乳房炎乳汁成份（如脂肪、蛋白质、碳水化合物、无机盐、非脂固形物等）的影响,根据乳样鉴定结果,选取隐性乳房炎中只检出S.aureus阳性的奶样4份记为A组,只检出S.agalactiae阳性的奶样14份记为B组,检出S.aureus+S.agalactiae阳性的奶样5份记为C组,正常奶样5份（对照组）记为D组。检出S.aureus+S.agalactiae+P.aeruginosa阳性的奶样仅1份记为E组（但不计入统计分析）,进行乳汁成份测定。结果:在A-D组中,对照组（D组）的脂肪、蛋白质、碳水化合物、非脂固形物、无机盐等指标的含量显著高于其他各组（A、B、C组）,（P≤0.05）,其中,乳汁中的脂肪、蛋白质、碳水化合物、非脂固形物的含量有极显著差异（P≤0.01）。单一感染的A组（S.aureus）和B组（S.agalactiae）在蛋白质、碳水化合物、非脂固形物、无机盐等指标的含量均高于混合感染的C组（S.aureus+S.agalactiae）,但无显著差异（P﹥0.05）。C组的脂肪含量显著低于A、B两组（P≤0.01）。其中,E组的脂肪、蛋白质、碳水化合物、非脂固形物等指标的含量均低于A、B、C、D组的平均值。综上,S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa感染引起隐性乳房炎的乳汁质量下降,其乳汁中的脂肪、蛋白质、碳水化合物、无机盐、非脂固形物等物质的含量均显著下降。结论:1、根据S.aureus NUC耐热基因、S.agalactiae 16S rRNA基因、P.aeruginosa ETA基因序列,设计特异性引物成功建立了多重PCR检测方法。2、使用细菌学检测和多重PCR检测两种方法对100份奶样进行S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的病原菌检测,其检测结果吻合率为96%、98%、97%。两种方法比较,吻合率较高,差异不显著,结果可靠。3、由S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa感染引起奶牛隐性乳房炎的乳汁质量降低,其乳汁中脂肪、蛋白质、碳水化合物、无机盐、非脂固形物等的含量均显著下降。