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猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由冠状病毒亚科(Coronavirinae)的α冠状病毒属(Alpha Coronavirus)猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种急性、高度接触性的肠道传染病。这种病毒可致各阶段的猪均能发病,但危害最为严重的是对10日龄以内的仔猪,临床上常引起仔猪脱水、呕吐和水样腹泻等症状。1971年在英国首先报道该病,随后在多个国家暴发流行。由于经典疫苗毒株CV777灭活苗或弱毒苗的使用,PEDV取得了较好的防控。但是好景不长,2010年冬季有人发现就算免疫过经典疫苗株的养猪场照样能发生该病,原因是PEDV发生了变异,变异毒株引发的严重腹泻病迅速席卷全球,近年来,临床上缺乏针对现行PEDV变异株的有效疫苗,一时间养猪业损失惨重,而该病也成为了危害养猪业的最为严重的疫病。因此,PED的防控具有重要的意义,而检测是防控的主要手段,但目前临床上缺少针对当前流行的PEDV变异毒株检测方法。本研究在GenBank中参照已登录的PEDV N(AF353511)基因序列,经过对比近年来流行株,设计出了一对特异性引物,将扩增后的目的片段(N基因)克隆到pQE-30原核表达载体中,进行表达、纯化,以纯化的重组N蛋白(rN)作为包被抗原,异性和重复性试验。对500份来源于不同猪场临床血清样品进行检测,并将结果与进口商品化试剂盒通过矩阵法优化ELISA反应条件,建立了 PEDV间接ELISA检测方法,并进行敏感性、特比较。结果表明,本研究成功扩增了长度1221bpN基因,表达的rN约为50.4 ku,western blot结果表明该试验所建立的ELISA方法反应原性良好。rN最佳包被浓度为2 μg/mL;血清最佳稀释度为1:100,作用时间1 h;羊抗猪HRP-IgG最适稀释度为1:5000,作用时间为30 min;TMB最佳显色时间为10 min。本方法可特异性检测PEDV抗体,而与PRV、PRRSV、CSFV、PCV、TG EV等病原的阳性血清均无交叉反应;本方法检测出相同血清的最高稀释倍数与中和试验基本一致,具有良好敏感性;批内、批间重复性检验变异系数均小于10%,具有较好的重复性和稳定性。对500份临床猪血清的检测,与进口商品化试剂盒相比符合率为99.6%。本研究为PEDV血清学检测提供了技术手段,也为下一步单克隆抗体(单抗)的筛选奠定基础。本研究按照常规技术免疫小鼠,将小鼠血清倍比稀释用所建立的间接ELISA方法检测小鼠抗体效价,将检测效价大于1:80000的小鼠脾脏充分研磨后过铜网,在PEG1500的作用下与事先培养好的SP2/0细胞进行融合,后将融合细胞铺到96孔板中,逐日观察细胞情况,取每孔上清液用建立的间接ELISA方法进行筛选鉴定,同时进行单抗亚型鉴定,对阳性孔进行5次亚克隆后,筛选出2株亚型为IgG且能稳定分泌抗PEDV N蛋白单抗的杂交瘤细胞株(2D4、6C6)。将杂交瘤细胞扩大培养并注射入小鼠腹腔,收集腹水后对其进行纯化,同时进行SDS-PAGE、稳定性、特异性检测。结果显示:制备腹水纯化后,2株中仅有1株(6C6),纯度高达95%以上,且其可以特异性地与 PEDV抗原反应,而与PRV、PRRSV、CSFV、PCV、TGEV、大肠杆菌等抗原均不发生交叉反应,特异性良好;经过连续几次传代后,其效价依然可达到1:102400,稳定性好。为进一步建立基于PEDV N蛋白抗体阻断ELISA及应用于临床的胶体金快速检测试纸条的方法奠定了基础。本研究用本实验室分离鉴定得到的病毒制备的灭活疫苗,进行免疫效力试验的研究。选取PEDV血清中和效价<1:4,且FQ-PCR检测为阴性的母猪所产的5日龄仔猪10头,分为2组,每组5头,免疫组口服病毒液(攻毒剂量1000TCID50/mL),对照组口服相同剂量的DMEM,在攻毒后3d内观察仔猪发病情况。结果显示:试验组均符合腹泻发病要求,对照组均未发病。用制备的灭活疫苗在临床上分别于母猪分娩前45d、分娩前21d和再次配种前7d免疫灭活疫苗,对照组在相同的时间里注射相同剂量的DMEM。选取免疫组和对照组分娩的仔猪进行攻毒免疫保护实验的研究。结果显示:试验组母猪所产仔猪获得的保护率能达到90%,对照组仔猪100%发病,且致死率为30%。且在精神状态、增重率、病原学检测和剖检症状等各方面试验组均比对照组要好。说明本实验室的毒株制备成灭活疫苗免疫接种给母猪,它能给仔猪提供有效保护,可用于当前猪流行性腹泻变异毒株疫苗的研发。