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近年来,相对于哺乳动物乳腺生物反应器,家禽输卵管生物反应器在转基因技术和生物制药研究方面具有更广阔的研究前景。哺乳动物乳腺作为生物反应器存在很多缺点,例如家畜时代间隔长,乳蛋白和脂肪生化成分复杂,重组蛋白难以纯化等,家禽输卵管生物反应器则克服了以上困难。卵清蛋白基因是组织特异性基因,能够特异性指导卵清蛋白在输卵管的表达,其表达的卵清蛋白占卵白蛋白总量的50%。因此,输卵管特异性表达外源基因的转基因鸡可以生产医学临床上紧缺的药用蛋白。试验方法:1、六个不同截短体鸡卵清蛋白启动子(OVP)克隆。通过EnsemLe在线分析卵清蛋白基因,预测5’-侧翼序列、内含子序列、UTR序列和翻译序列,截取不同长度的启动子序列设计引物,从产蛋母鸡输卵管中提取基因组DNA,PCR扩增六个启动子并构建相应的克隆载体,即pMD18-T-OVP 944、pMD18-T-OVP 1548、pMD18-T-OVP 1667、pMD18-T-OVP 1999、pMD18-T-OVP 2556 和 pMD18-T-OVP 3606。2、pGL3-OVP表达载体构建。以双酶切法从克隆载体pMD18-T-OVP获取各个OVP片段,并分别克隆至线性化载体pGL3-Basic,构建pGL3-OVP系列表达载体。3、利用双荧光素酶检测OVP转录活性。利用FuGENE-HD转染试剂将去内毒素的pGL3-OVP和pRL-TK质粒共转染293 FT细胞,48h后收集细胞,以微孔板发光检测进行双荧光素酶活性检测。4、重组慢病毒载体构建。利用先进的Gateway技术,将OVP 1548、OVP 1999 和 OVP 3606 分别克隆至 pENTR 5’-TOPO,构建 pENTR 5’-TOPO-OVP 1548、pENTR 5’-TOPO-OVP 1999 和 pENTR 5’-TOPO-OVP 3606,这三个载体分别与pENTR D-TOPO-EGFP连接至慢病毒载体pLenti 6.4/R4R2/V5-DEST,重组质粒分别命名为 pLenti-OVP 1548-EGFP、pLenti-OVP 1999-EGFP、pLenti-OVP 3606-EGFP。5、慢病毒包装。利用FuGENE-HD转染试剂,将三个重组慢病毒载体分别转染293 FT细胞,转染48 h后收集病毒上清,并于荧光显微镜下观察EGFP表达情况。6、慢病毒浓缩与慢病毒感染293 FT细胞。收集的病毒上清感染293 FT皮细胞和鸡输卵管上皮细胞。结果表明:(1)本研究成功克隆了 OVP944、OVP1548、OVP 1667、OVP1999、OVP2556、OVP3606六个卵清蛋白启动子截短体。(2)双荧光素酶检测结果显示,在所克隆的6个启动子中,OVP 1548的转录活性最高。(3)慢病毒载体转染293 FT细胞,荧光显微镜观察证实,pLenti-OVP 1548-EGFP的转染效率最高,与双荧光素酶检测结果一致。(4)pLenti-OVP 1548-EGFP对293 FT细胞和鸡输卵管上皮细胞的感染效率远逊于pLenti-CMV-EGFP,由此证明,尽管OVP-1548具有最高的转录活性,但与通用启动子CMV相比,转录活性相差甚远。本研究设计并克隆了不同长度、包含不同元件的卵清蛋白启动子,通过双荧光素酶测定其活,重组慢病毒感染293FT细胞加以验证,为构建高特异性卵清蛋白启动子,进而为获得在卵白中生产药用蛋白的转基因鸡奠定了基础。