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实验目的:角蛋白-14阳性(KRT14+)上皮细胞是唾液腺发育过程中极为重要的一群前体细胞,在成体唾液腺中也仍存有部分KRT14+前体细胞以维持唾液腺导管稳态及损伤后唾液腺导管再生。因此,KRT14+唾液腺前体细胞的存活及分化能力的保存是唾液腺维持生理性稳态、修复病理性损伤的关键。然而,成体唾液腺中KRT14+前体细胞维持自身活力及分化潜能的机制尚未完全明了。自噬是一种在进化上高度保守的生物学过程。在大量自噬相关蛋白及细胞内膜结构的协同作用下,自噬有序而精密地对胞内错误折叠蛋白及受损细胞器进行清除,进而维持细胞内稳态。自噬广泛参与了细胞分化及器官发育,在细胞抵御内外刺激中也扮演着重要的角色。然而自噬在KRT14+前体细胞主导的唾液腺稳态维持及损伤修复中的研究仍有待深入。因此,本课题通过构建KRT14+前体细胞中特异性敲除自噬关键基因Atg5的条件性敲除小鼠,探究其唾液腺表型及增龄性变化,初步揭示了自噬在KRT14+前体细胞维持唾液腺稳态中的作用及其可能的机制。实验方法:(1)为得到KRT14+细胞中特异性敲除Atg5的小鼠,本实验利用Krt14-Cre工具小鼠与Atg5f/f小鼠交配得到杂合子小鼠(Krt14-Cre;Atg5f/+),利用杂合子小鼠与Atg5f/f小鼠交配得到条件性敲除小鼠(cKO,Krt14-Cre;Atg5f/f)并用于后续实验。(2)为探究增龄性变化对KRT14+前体细胞自噬缺陷的mSMGs的影响,本实验选取了 3月龄和8月龄的cKO小鼠与对照组小鼠下颌下腺(mSMGs)进行表型分析。(3)本实验利用苏木素和伊红(H&E)染色明确各组mSMGs组织学变化。(4)利用免疫组织化学染色明确了各组mSMGs中自噬相关蛋白(ATG5,LC3,p62,Ubiquitin)、细胞、凋亡相关标记物(Caspase3)、唾液腺细胞表面标记物(AQP5,KRT14)、细胞焦亡相关蛋白(NLRP3,Caspase1,IL-1β)的表达。(5)为明确自噬敲除对唾液腺内各细胞亚群的不同影响,本实验利用免疫荧光染色共定位了相关功能蛋白(ATG5,Caspase3,Capase1,Ki67)与唾液腺细胞标记蛋白(KRT14,AQP5),从而探究不同细胞亚群内细胞凋亡、细胞增殖及自噬相关蛋白的表达变化。(6)为明确自噬敲除对唾液腺功能的影响,本实验收集了各组小鼠唾液,通过检测唾液流量变化、唾液缓冲能力强弱以及唾液钙离子浓度高低,明确唾液性质的改变,从而探究KRT14+前体细胞中自噬缺陷对唾液腺功能的影响。实验结果:(1)cKO小鼠大体观较对照组无明显变化,其唾液腺外观也无明显改变。(2)KRT14+前体细胞中特异性敲除Atg5抑制了 cKO组小鼠唾液腺导管细胞内自噬的激活。(3)3月龄小鼠中,cKO小鼠SMGs在组织形态和唾液腺功能等方面无明显差异,但cKO小鼠SMGs内存在细胞凋亡的激活。(4)8月龄小鼠中,cKO组小鼠SMGs表型出现显著的增龄性变化。与对照组相比,8月龄cKO小鼠SMGs中可见导管细胞肥大、细胞内泛素阳性颗粒堆积,还可见导管细胞凋亡激活,导管间细胞焦亡出现;8月龄cKO小鼠出现以唾液出现分泌减少、缓冲能力减弱、钙离子含量降低为代表的唾液腺功能损伤,而对照组没有出现唾液分泌能力和唾液理化性质的改变。实验结论:KRT14+唾液腺前体细胞中,Atg5的缺失抑制了自噬。自噬缺陷的KRT14+唾液腺前体细胞并未影响唾液腺发育,而是导致了唾液腺增龄性损伤及功能障碍。其可能机制在于:随着年龄增长,自噬缺陷KRT14+前体细胞分化为导管细胞以维持唾液腺稳态,而新分化的导管细胞因自噬缺陷而存在功能障碍,同时唾液腺中细胞凋亡和细胞焦亡同时激活,导致了 cKO组小鼠唾液腺中的增龄性损伤。