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第一部分,人白介素12基因的克隆.溶瘤病毒是一类在肿瘤细胞中特异性增殖的病毒.以溶瘤病毒为载体将外源抗癌基因导入肿瘤细胞是刘新垣院士提出的一种治疗肿瘤的新方法,称为"溶瘤病毒的基因治疗".该组采用了AD5型重组腺病毒系统来构建这一类溶瘤病毒.这一系统由病毒基因组质粒pBHG-E3和携带外源基因的穿梭质粒重组而成.为构建穿梭质粒pCA13-hIL-12和pZD55-hIL-12,该实验先将PCR扩增得到的人白介素12基因克隆到质粒pCA13中,再将hIL-12基因连同pCA13中的表达框一起克隆到质粒pZD55中.在质粒构建的过程中还在hIL-12基因中引入一个同义突变.经过酶切及测序鉴定,实验成功构建了质粒pCA13-hIL-12△和pZD55-hIL-12△,hIL-12基因的序列除一处点突变外其余完全正确.点突变处的Bgl Ⅱ核酸内切酶酶切位点失活,hIL-1 2氨基酸序列没有改变.两个穿梭质粒用于构建无增殖功能的腺病毒AD-CA13-hIL-12和具有肿瘤特异增殖功能的腺病毒AD-ZD55-hIL-12.第二部分,胆固醇对hVEC的损伤及单核细胞趋化蛋白-1表达的影响.血管内皮细胞的损伤是动脉粥样硬化(AS)发病的起始环节,该工作研究了动脉壁大量沉积的胆固醇对血管内皮细胞的损伤作用及其对单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响.实验采用人脐静脉内皮细胞株ECV304为效应细胞,分别以浓度为6.25mg/L,12.5mg/L,25.0mg/L,50.0mg/L的胆固醇作用于ECV304,用LDH检测试剂盒检测培养液中LDH活性,细胞LDH渗出率,用高效液相色谱法检测了基因组DNA甲基化水平,同时用酶联免疫吸附法检测了ECV304的MCP-1表达以及用比色法检测了培养液中一氧化氮的生成量和一氧化氮合酶活性.结果与无胆固醇的对照组比较,胆固醇浓度为50.0mg/L时培养液中LDH活性显著增加,25.0mg/L,50.0mg/L浓度组的细胞LDH渗出率有显著增加,胆固醇浓度为50.0mg/L时DNA甲基化水平有显著下降.6.25mg/L,12.5mg/L,25.0mg/L,50.0mg/L浓度组与对照组比较,MCP-1的表达量随胆固醇浓度的提高而增加,NOS活性随胆固醇浓度的提高而降低.胆固醇浓度为25.0mg/L,50.0mg/L时培养液中NO的量显著降低.说明高浓度胆固醇能直接损伤血管内皮细胞,降低细胞DNA甲基化水平.胆固醇能诱导血管内皮细胞表达MCP-1蛋白,可能与胆固醇降低了NOS的活性,减少了NO的产生有关.