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研究背景: 结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升，严重危害着人类的健康。结直肠癌的致病过程是一个复杂的、多因素共同参与的综合过程，其中氧化应激在癌症的发生、发展过程中发挥着至关重要的作用，而线粒体的生物学功能与肿瘤细胞内的氧化应激密切相关。正常情况下，机体拥有完善的抗氧化系统，位于线粒体基质内的锰超氧化物歧化酶（MnSOD）能够清除从氧化呼吸链上泵出的超氧根自由基对细胞的损害，是细胞内抗氧化应激的重要防线。MnSOD蛋白表达的变化能够影响肿瘤细胞内的氧化还原状态，与癌症的发生、发展过程密切相关。但目前关于MnSOD在癌症中的作用仍存在一定的争议，其究竟是作为促癌因子还是抑癌因子参与到癌症发生中，目前尚无确切定论。我们前期研究发现结直肠癌中MnSOD蛋白的表达显著高于癌旁正常组织，本研究中通过Oncomine数据库分析也证实MnSOD mRNA 在结直肠癌中表达升高，提示MnSOD在结直肠癌发生发展中具有重要作用，但其具体作用及机制有待进一步阐明，尤其是MnSOD的异常表达对结直肠癌细胞氧化还原状态、增殖、侵袭迁移等生物学特性的影响值得深入研究。 目的: 1. 挖掘肿瘤数据库（Oncomine）中的有效信息，进一步验证前期课题组的实验结果。同时，为后续的深入研究提供有力的理论指导。 2. 构建MnSOD敲低的细胞模型，观察其对结直肠癌细胞增殖能力的影响。 3. 观察MnSOD对于结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响。 4. 观察MnSOD对结直肠癌细胞内氧化还原状态的影响。 5. 观察MnSOD对于线粒体功能的影响。 6. 初步探讨MnSOD通过影响线粒体功能导致结直肠癌细胞生长特性发生改变的机制。 方法: 1. 利用Oncomine数据库，查询与正常结直肠组织相比，结直肠癌组织中MnSOD mRNA 的表达情况。 2. 利用SDS-PAGE检测多种结直肠癌细胞：HT29（Duke A期），SW480（Duke B期），SW620（Duke C期），DLD-1（Duke C期），HCT15（Duke C期）中MnSOD蛋白的表达水平，探讨MnSOD表达水平与结直肠癌分期的关系。 3. 选取两株人源结直肠癌细胞（SW480和DLD-1），通过RNA干扰技术降低MnSOD蛋白的表达。 4. 通过细胞计数、CCK-8以及平板克隆实验检测MnSOD蛋白对结直肠癌细胞的增殖活性的影响。 5. 细胞划痕实验、Transwell小室等实验分析MnSOD蛋白对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响。 6. 通过不同的荧光标记探针检测细胞内的线粒体内的ROS以及总ROS含量，观察结直肠癌细胞内的总体氧化应激状态的改变。 7. 通过Bluenative Native-PAGE技术检测MnSOD水平降低对结直肠癌细胞内复合体含量变化的影响；检测线粒体的膜电位变化；利用葡萄糖及2-DG对细胞内总的ATP生成水平以及线粒体产生ATP的含量进行检测，以分析MnSOD表达变化对线粒体功能的影响。 8. 通过SDS-PAGE技术检测MnSOD低表达的结直肠癌细胞中的重要信号通路蛋白（AMPKα，P38，JNK，ERK）表达水平的变化。 9. 通过葡萄糖吸收实验及细胞培养基中乳酸含量的检测，探讨MnSOD蛋白表达变化对结直肠癌细胞内糖酵解水平改变的影响。 结果: 1. 在Oncomine数据库中发现，与正常的结肠和直肠组织相比，MnSOD mRNA在多种类型的结直肠癌组织中的表达量都显著增高，且具有统计学意义。 2. 不同分期的结直肠癌细胞中，具有高侵袭、高转移能力的肿瘤细胞中，MnSOD蛋白的表达量相对较高。 3. 选取SW480和DLD-1两种结直肠癌细胞系构建MnSOD低表达的细胞模型。结果显示干扰MnSOD蛋白表达后，结直肠癌细胞的增殖能力、细胞活力以及单个癌细胞的存活能力下降，且差异具有统计学意义。 4. 干扰MnSOD蛋白的表达后，结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力均下降，且差异具有统计学意义。 5. MnSOD蛋白能够降低线粒体内ROS的生成，但同时也增加细胞内总的过氧化物的含量，从而使结直肠癌细胞在总体水平上处于氧化应激状态。 6. MnSOD能够维持线粒体膜电位水平的稳定，维持细胞内总的ATP生产水平以及线粒体ATP生成能力；此外，MnSOD蛋白低表达过后，结直肠癌细胞的线粒体复合体I的表达水平有所下降。 7. 干扰MnSOD蛋白表达后，SW480和DLD-1细胞中，AMPKα及其磷酸化水平降低，而其他增殖过程中的关键信号分子（AMPK, P-38、JUNK、Akt1、ERK、MERK）的表达无显著变化。 8. 通过检测细胞内的葡萄糖吸收能力以及细胞培养基中的乳酸含量，发现MnSOD蛋白表达水平降低后，结直肠癌细胞的葡萄糖吸收能力增加，但其培养环境中的乳酸水平却降低了，同时细胞内的糖酵解标志物MCT4的表达水平也显著下降，表明MnSOD能够维持结直肠癌细胞糖酵解能力。 结论: 1. Oncomine 数据库分析表明，与正常的结肠组织和直肠组织相比，在不同分期的结直肠癌组织中, MnSOD mRNA的表达水平显著增高，与课题组的前期的蛋白水平研究结果一致； 2. MnSOD蛋白能够维持结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。 3. 病理状况下，MnSOD蛋白可以维持结直肠癌细胞内的氧化应激状态。 4. MnSOD蛋白能够维持结直肠癌细胞内线粒体的膜电位水平及癌细胞稳定的ATP生成能力。 5. MnSOD蛋白通过调节AMPKα及其磷酸化状态，调节结直肠癌细胞的能量代谢，保护细胞内的氧化磷酸化水平，同时也促进糖酵解，为结直肠癌细胞的一系列生长特性提供能量。