基于干细胞的研究是牙周再生治疗的一个重要研究方向,且大部分的动物实验或临床研究都取得了较好效果,然而,也有部分临床研究并未获得理想结果。因此,如何利用干细胞获得更好的牙周再生,仍是非常重要的课题。第一部分 骨髓间充质干细胞和牙周膜干细胞联合修复大鼠牙周组织缺损的效果观察[研究目的]观察BMMSC与PDLSC联合应用在免疫健全动物的牙周缺损修复中是否能获得更好的再生效果。[研究方法]将BMMSC,PDLSC和BMMSC+PDLSC组织工程化复合物植入SD大鼠牙周缺损,并通过影像学和组织病理学方法观察组织再生效果,通过免疫组织化学方法显示组织中不同亚型巨噬细胞的分布情况,并初步分析其与愈合结果之间的关系。[研究结果]在体外,BMMSC和PDLSC联合应用显示出比PDLSC有更好的成骨向分化。然而,在体内实验中,两种细胞联合应用没有实现比PDLSC更好的牙周再生。[结论]采用干细胞治疗牙周缺损时,有必要关注其再生微环境。第二部分 牙周再生过程中M1/M2型巨噬细胞的动态变化[研究目的]解巨噬细胞是否参与了牙周组织再生过程,并初步探索不同亚型巨噬细胞和组织愈合过程的关系。[研究方法]手术建立大鼠下颌骨缺损模型,采用micro-CT评价术后28天的骨再生情况,采用组织病理学方法观察术后1天、3天、5天、7天、14天、21天和28天的组织愈合情况,通过免疫组织化学方法观察组织愈合不同时期巨噬细胞的分布、数量和类型。[研究结果]牙周手术后不同时期,巨噬细胞的数量和分布随时间变化而变化,M1型巨噬细胞在术后第3天明显增多,从第5天起,其数量显著减少,直到观察期结束的第28天,该细胞的数量仍保持在较低水平。而M2型巨噬细胞在骨缺损愈合过程中出现较晚,且数量较少,其出现时期与组织改建期对应。[结论]牙周缺损愈合过程中,巨噬细胞处于动态变化,且其变化与组织愈合过程相关。第三部分 间充质干细胞对M1/M2型巨噬细胞增殖、极化和功能的影响[研究目的]探讨间充质干细胞对不同亚型巨噬细胞的增殖、凋亡、吞噬功能、分泌功能和极性变化的影响。[研究方法]用CCK-8法测定间充质/基质干细胞（mesenchymal stromal/stem cells,MSC）对巨噬细胞增殖的影响;采用ANNIXEN V和PI双染的方法测定MSC对巨噬细胞凋亡的影响;采用流式细胞术检测MSC对巨噬细胞极化状态的影响;采用中性红吞噬实验验证MSC对巨噬细胞吞噬功能的影响;采用ELISA法检测MSC对巨噬细胞分泌相关蛋白的影响。[研究结果]MSC-CM对巨噬细胞增殖无明显影响,但抑制M0巨噬细胞凋亡,轻微诱导M1巨噬细胞凋亡。MSC-CM可以降低M1巨噬细胞表面上的CD80表达。此外,它可以促进M0巨噬细胞表面CD163表达,抑制M1巨噬细胞表面CD 163表达,然而,MSC-CM倾向于最初促进M2型巨噬细胞上的CD163表达,但在一定时间后抑制其表达。MSC-CM对巨噬细胞中TNF-α和IL-10的表达没有显著影响。[结论]间充质干细胞对不同亚型巨噬细胞的免疫调节作用是不同的,因此,组织中原有巨噬细胞的亚型可能会影响干细胞免疫调节功能的发挥,从而影响干细胞治疗的疗效。第四部分M1/M2型巨噬细胞对间充质干细胞生物学行为的影响[研究目的]探讨不同亚型巨噬细胞对间充质干细胞增殖、成骨向分化和抵抗氧化应激能力的影响。[研究方法]采用CCK-8法测定巨噬细胞对MSC增殖和活力的影响;采用茜素红染色法检测巨噬细胞对MSC成骨向分化的影响,采用过氧化氢模拟氧化应激微环境,采用CCK-8法测定不同亚型巨噬细胞对MSC抵抗氧化应激能力的影响。[研究结果]M1微环境会降低MSC的活力,并且抑制其成骨向分化,但增强其抵抗氧化应激的能力。M2微环境中的MSC活力变强,但是,其抵抗氧化应激的能力明显减弱。[结论]不同亚型巨噬细胞对干细胞增殖、分化和抵抗氧化应激的影响不同,因此,组织中不同亚型巨噬细胞可能会通过影响干细胞本身的生物学功能从而影响干细胞治疗的疗效。以上四个部分实验结果提示:干细胞治疗的疗效可能受周围微环境的影响。采用干细胞治疗牙周缺损前,应明确组织中巨噬细胞的亚型和数量,甚至可以考虑改变巨噬细胞亚型以提高再生效果,然而,过早提高组织中M2型巨噬细胞的数量可能并不利于MSC在组织愈合早期的氧化应激微环境中的存活。