骨质疏松症（OP）是一种以骨量减少、骨质量降低及骨微结构损坏为特征的系统代谢性疾病。根据发病原因将其分为三大类,第一类为因随着年龄增长必然发生的原发性骨质疏松,包括老年性骨质疏松和绝经后骨质疏松症（PMOP）;第二类为因某些疾病或者药物诱导引起的骨质疏松,即继发性骨质疏松症;第三类为因遗传因素或妊娠、哺乳期引起的骨质疏松,即特发性骨质疏松症。其中,以绝经后骨质疏松症最为常见,其主要的发病机制是雌激素缺乏、减少后,骨代谢转换亢进,骨吸收超过骨形成从而导致骨量减少。近年来人口老龄化日益严重,骨质疏松患者也越来越多,无论是对个人还是对社会都造成了不可估计的损失,现阶段用于防治绝经后骨质疏松的药物多为雌激素替代药,临床研究表明此类药物长期服用可诱发子宫内膜癌、血管栓塞等疾病,不适合患者长期使用。然而,随着技术的不断发展及科学研究的不断深入,植物雌激素类药物常用于防治绝经后骨质疏松症,本课题组前期已用大量实验证明补骨脂素、异补骨脂素、五味子甲/乙素等植物雌激素类药物可以促进大鼠成骨细胞（OB）的增殖及分化,在前期实验的基础上,本实验目的在于研究香豆素类植物雌激素佛手柑内酯对成骨细胞生物活性的影响及BGS3促进成骨细胞增殖及提高ALP活性的机制,为绝经后骨质疏松的治疗提供有效的靶点及理论依据。第一部分:佛手柑内酯对大鼠成骨细胞生物活性的影响目的:探索佛手柑内酯对大鼠成骨细胞生物活性的影响。方法:1大鼠成骨细胞的原代培养及形态学观察;2噻唑蓝比色法（MTT法）测定不同浓度的佛手柑内酯处理细胞24、48和72 h后大鼠成骨细胞的增殖;3微量酶标法测定不同浓度佛手柑内酯处理细胞48和72 h后碱性磷酸酶（ALP）的活性;4酶联免疫吸附法（ELISA）测定不同浓度佛手柑内酯处理细胞48和72 h后大鼠成骨细胞骨钙素（BGP）的含量;5定量PCR测定不同浓度佛手柑内酯处理细胞48和72 h后大鼠成骨细胞Ⅰ型胶原（collagenⅠ）mRNA的表达量。结果:1大鼠成骨细胞的形态学观察及鉴定倒置显微镜下观察:细胞接种在培养瓶中24 h后,大部分细胞贴壁,细胞贴壁初期形状多样,呈多边形、梭形、长条形,有1²个核仁,细胞核大且轮廓清晰,36、48和72 h后,可见细胞密度逐渐增大,由长条形渐变为卵圆形,且细胞间的边界逐渐小时至融合成片。ALP染色后可见大部分区域呈紫色,颜色浅深不同,其染色阳性率为92%。2增殖实验与对照组比较,不同浓度佛手柑内酯作用于成骨细胞24、48和72 h后,均表现为佛手柑内酯浓度为1.0×10^-99 mol/L时,可促进成骨细胞的增殖（P<0.05）,其中48和72 h时促增殖作用最为显著（P<0.01）。3佛手柑内酯对大鼠成骨细胞ALP活性的影响与对照组比较,不同浓度的佛手柑内酯作用于细胞48 h后,0.3×10^-8mol/L,1.0×10^-99 mol/L和0.3×10^-99 mol/L浓度的佛手柑内酯对成骨细胞ALP的活性均有显著的增强作用（P<0.001）,作用72 h后,1.0×10^-99 mol/L和0.3×10^-99 mol/L浓度的佛手柑内酯均增强了ALP的活性,且增强作用很明显（P<0.001）。4佛手柑内酯对大鼠成骨细胞骨钙素含量的影响与对照组相比,不同浓度的佛手柑内酯作用于细胞48 h后,0.3×10^-9mol/L、0.3×10^-88 mol/L浓度的佛手柑内酯可明显的促进成骨细胞骨钙素分泌,0.3×10^-88 mol/L组最为显著（P<0.001）;而给药处理72 h后,1.0×10^-8mol/L的佛手柑内酯对成骨细胞骨钙素的分泌有明显的促进作用（P<0.001）。5佛手柑内酯对大鼠成骨细胞Ⅰ型胶原mRNA表达的影响与对照组比较,不同浓度的佛手柑内酯分别作用于大鼠成骨细胞48和72 h后,由统计结果看出,48 h时,0.3×10^-88 mol/L的佛手柑内酯对Ⅰ型胶原mRNA表达有明显的促进作用（P<0.001）;72 h时,0.3×10^-99 mol/L的佛手柑内酯对Ⅰ型胶原mRNA表达有明显的促进作用（P<0.001）。结论:1一定浓度佛手柑内酯可促进大鼠成骨细胞的增殖。2佛手柑内酯可提高成骨细胞碱性磷酸酶活性、促进骨钙素及Ⅰ型胶原mRNA的表达,从而促进大鼠成骨细胞的分化。第二部分:BGS3对大鼠成骨细胞增殖和ALP活性影响的信号通路研究目的:研究BGS3促进大鼠成骨细胞增殖及提高ALP的活性是否与ERK通路有关。方法:1大鼠成骨细胞的原代培养和形态学观察。2噻唑蓝比色法（MTT法）测定药物处理24、48和72 h后大鼠成骨细胞的生长情况。3微量酶标法测定大鼠成骨细胞在药物处理48和72 h后碱性磷酸酶（ALP）的活性。4定量PCR测定成骨细胞在药物处理48和72 h后,ALP mRNA表达情况。结果:1大鼠成骨细胞的形态学观察及鉴定鉴定结果同第一部分2增殖实验对大鼠成骨细胞给药处理24 h时,E₂组与PD+E₂组、BGS3组与PD+BGS3组对比均无统计学差异（P>0.05）;48 h数据表明,与空白组比较,E₂和BGS3组均可促进成骨细胞的增殖,E₂组更加明显（P<0.01）,E₂组与PD98059+E₂组（P<0.001）、BGS3组与PD98059+BGS3组比较（P<0.01）,ERK通路抑制剂PD98059均可明显抑制雌二醇（E₂）和BGS3对大鼠成骨细胞的促增殖作用;72 h的数据同样表明与空白组比较,E₂和BGS3组均可明显促进成骨细胞的增殖,BGS3组最为显著（P<0.001）,E₂组与PD98059+E₂组、BGS3组与PD98059+BGS3组比较,ERK通路抑制剂PD98059均可明显抑制雌二醇（E₂）和BGS3对大鼠成骨细胞的促增殖作用（P<0.001）。3基于ERK信号转导通路,BGS3对成骨细胞ALP活性的影响按照分组对成骨细胞进行药物处理,48 h时,与空白组比较,E₂和BGS3组均可增强成骨细胞ALP的活性（P<0.001）,E₂组与PD98059+E₂组、BGS3组与PD98059+BGS3组比较,ERK通路抑制剂PD98059均可明显抑制雌二醇（E₂）和BGS3对大鼠成骨细胞ALP活性的增强作用（P<0.001）;在72 h时同样发现,与空白组比较,E₂和BGS3组均可增强成骨细胞ALP的活性（P<0.001）,E₂组与PD98059+E₂组、BGS3组与PD98059+BGS3组比较,ERK通路抑制剂PD98059均可明显抑制雌二醇（E₂）和BGS3对大鼠成骨细胞ALP活性的增强作用（P<0.001）。4基于ERK信号转导通路,BGS3对成骨细胞ALP mRNA表达的影响给药处理48 h时,与空白组比较,E₂和BGS3组均可促进成骨细胞ALP mRNA的表达,E₂组最为显著（P<0.01）,E₂组与PD98059+E₂组、BGS3组与PD98059+BGS3组比较,ERK通路抑制剂PD98059均可显著抑制雌二醇（E₂）和BGS3对大鼠成骨细胞ALP mRNA表达的促进作用（P<0.001）;在72 h时同样发现,与空白组比较,E₂和BGS3组均可促进成骨细胞ALPmRNA的表达（P<0.05）,E₂组与PD98059+E₂组（P<0.05）、BGS3组与PD98059+BGS3组（P<0.01）比较,ERK通路抑制剂PD98059均可明显抑制雌二醇（E₂）和BGS3对大鼠成骨细胞ALP mRNA表达的促进作用。结论:1 BGS3经ERK信号通路促进大鼠成骨细胞的增殖。2 BGS3经ERK信号通路增强大鼠成骨细胞碱性磷酸酶的活性及ALP mRNA的表达。