人溶菌酶是人体中一种非特异性免疫因子,与人体具有天然相容性,对人体完全没有毒副作用,并具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤等作用,在临床、食品工业和畜牧业等领域应用广泛,但目前仍未实现重组人溶菌酶高产菌株和规模化生产工艺的突破。除此之外,在阿尔兹海默症发病机制和药物研究中,由于人溶菌酶是含有多种典型二级结构和二硫键的蛋白,因此成为通过淀粉样纤维化进行抑制剂药物筛选的理想模型。基于此,本课题围绕重组人溶菌酶毕赤酵母高产菌株的构建表达与发酵工艺,以及人溶菌酶在淀粉样纤维化抑制剂筛选中的应用进行了研究。下面是两个方面研究工作的主要内容:（一）重组人溶菌酶毕赤酵母表达菌株的构建和发酵工艺研究本研究将含人溶菌酶基因的表达质粒p PIC9K通过电转化的方法整合到巴斯德毕赤酵母中,构建了人溶菌酶毕赤酵母工程菌株并进行表型鉴定,确定菌株为Muts型,进一步通过G418抗性筛选确定了一株高拷贝的人溶菌酶毕赤酵母重组菌株。同时,建立了高效液相色谱法检测人溶菌酶活性的方法,并进行方法学验证,该方法可完全替代生物法检测溶菌酶活性,提高了分析检测的效率和精确度。此外,本课题先在摇瓶水平对高拷贝人溶菌酶毕赤酵母菌株的发酵条件进行单因素实验,通过考察不同诱导时间、温度、甲醇含量、p H值及装液量对诱导表达人溶菌酶含量的影响,初步优化出重组人溶菌酶毕赤酵母菌株最佳的发酵条件为:将p H为5.5、装液量为25 m L的摇瓶（500 m L）放在28℃、转速为220 rpm的摇床中,诱导120 h,在诱导过程中甲醇诱导含量保持为2%,每24 h补充一次。接下来在发酵罐水平进行甲醇流加方式优化,以菌体量（干重、湿重）、酶活和SDS-PAGE为评价指标,考察了恒速流加、p H反馈流加、DO反馈流加和指数流加这四种甲醇补料方式对诱导表达人溶菌酶的影响。优化结果为在DO反馈流加的补料方式下,在28℃、p H5.5的发酵罐环境中,诱导132 h时人溶菌酶表达量最高,酶活能够达到49422.78 U/mg。该优化结果为毕赤酵母工业化诱导表达人溶菌酶工艺的开发提供了新的思路。（二）人溶菌酶在淀粉样纤维化及其抑制剂筛选中的应用蛋白淀粉样纤维化被认为是阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和2型糖尿病（T2DM）等许多神经退行性疾病的重要病因,体外建立淀粉样蛋白纤维化模型被认为是寻找淀粉样蛋白纤维化抑制剂的常用策略。已有研究表明,植物的天然产物可以维持蛋白质的天然构象,并具有治疗神经退行性疾病的活性。本研究成功构建了人溶菌酶淀粉样纤维化模型,并筛选出番泻苷A和番泻苷C两个抑制剂化合物,结合生物物理方法和分子对接工具,评价番泻苷A和番泻苷C对淀粉样纤维化的抑制作用。硫黄素-T（Th T）、8-苯胺-1-萘磺酸（ANS）和刚果红（CR）检测结果表明,番泻苷A和番泻苷C均能以剂量依赖性的方式抑制人溶菌酶淀粉样蛋白纤维性颤动,番泻苷A和番泻苷C对人溶菌酶纤维化的IC50值分别为200.09μM和186.20μM。然后通过透射电子显微镜和原子力显微镜观察形态外貌特征进一步证实了这一发现,番泻苷A或番泻苷C的加入均显著减少人溶菌酶的淀粉样纤维化。此外,还通过荧光淬灭、紫外吸收光谱和分子对接研究了人溶菌酶与番泻苷A和番泻苷C的相互作用。结果表明,番泻苷A和番泻苷C都能通过氢键、范德华力和疏水作用与人溶菌酶结合,形成稳定的复合物。综上所述,我们的实验显示,番泻苷A和番泻苷C均能起到抑制人溶菌酶淀粉样纤维性聚集的作用。