【摘 要】
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草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国重要的淡水养殖鱼类之一,其肉质厚嫩、味道鲜美、生长速度快、易养殖等特点而深受广大消费者和养殖者的青睐,是我国大宗淡水经济鱼类养殖的重要组成部分。但由草鱼呼肠弧病毒(Grass carp reovirus,GCRV)引起的草鱼出血病严重制约草鱼养殖业的健康发展。Viperin是一种具有广谱性抗病毒蛋白,在鱼类天然免疫中发挥重要作用,但其在
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草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国重要的淡水养殖鱼类之一,其肉质厚嫩、味道鲜美、生长速度快、易养殖等特点而深受广大消费者和养殖者的青睐,是我国大宗淡水经济鱼类养殖的重要组成部分。但由草鱼呼肠弧病毒(Grass carp reovirus,GCRV)引起的草鱼出血病严重制约草鱼养殖业的健康发展。Viperin是一种具有广谱性抗病毒蛋白,在鱼类天然免疫中发挥重要作用,但其在发挥抗病毒功能的作用机制对于不同病毒存在差异,当前草鱼Viperin抗病毒作用机制还没有报道。因此,本研究通过快速扩增c DNA末端技术(Rapid Amplification of c DNA Ends,RACE)方法克隆了草鱼Viperin(CiViperin)基因,生物信息学分析其结构,并开展了Viperin抗GCRV功能的初步研究,旨在为进一步探讨草鱼Viperin的功能奠定基础。本研究采用RACE技术克隆草鱼Viperin基因的c DNA序列,通过生物信息学方法分析CiViperin基因的结构特点、进化关系和基因的共线性比较;采用荧光定量PCR方法分析草鱼Viperin在正常组织,以及在GCRV、Poly(I:C)、LPS攻毒下草鱼相关免疫组织中的表达;构建p EGFP-N1-Flag-Viperin的表达载体探讨Viperin在CIK细胞中抗草鱼GCRV的初步功能。结果显示,克隆的草鱼Viperin基因c DNA全长为1885bp,其中包括5′端非编码区域(UTR)29bp,3′UTR 776bp,开放阅读框(ORF)1080bp,编码359个氨基酸;Expasy预测CiViperin蛋白分子量为41.56KD,理论等电点为8.56;草鱼Viperin基因组结构由6个外显子和5个内含子组成。SMART结构域预测显示CiViperin含有1个Elp3经典结构域;CiViperin 3D结构由12个α-螺旋和14个β-折叠构成。系统进化树显示,CiViperin氨基酸序列与鱼类Viperin聚为一支,且与青鱼具有高度相似性和同源性。CiViperin基因在健康草鱼的肝、脾、肾、头肾、鳃、皮肤、肌肉、肠、脑、心10个组织中均有表达,且在鳃和脾脏中表达量较高,脑和心次之;GCRV攻毒后,CiViperin基因在肝脏、脾脏、肾脏和头肾组织中的表达水平总体呈现出先上升后下降的趋势,肝脏中表达最高峰出现在GCRV攻毒后120h(P<0.05),脾脏表达最高峰出现在GCRV攻毒后168 h(P<0.05)。肾脏中的表达最高峰出现在GCRV攻毒后24 h(P<0.05),头肾组织中CiViperin基因在攻毒后72h表达水平最高(P<0.05);Poly(I:C)、LPS刺激后,草鱼肝脏、脾脏、肾脏和头肾组织中CiViperin基因的表达水平首先总体呈现上调的趋势,随着时间延长则出现表达下降,在中间时间段poly(I:C)、LPS的刺激都可以引起肝脏、脾脏、肾脏和头肾组织中CiViperin基因的表达水平上调,与对照组比较差异显著(P<0.05),随检测时间点延长CiViperin基因的表达水平略有下降;过表达CiViperin检测草鱼GCRV的VP7在CIK细胞中的m RNA表达结果显示,12 h开始VP7的m RNA表达显著下降,且在12 h、24 h GCRV的VP7基因表达水平与对照组相比差异显著(P<0.05),说明Viperin对GCRV的VP7基因转录表达具有一定的抑制作用。综上,草鱼Viperin基因结构具有经典的Elp3结构域,在进化上与鱼类Viperin聚合相近,同源性较高;草鱼Viperin基因在不同组织中有基础表达,且在GCRV、Poly(I:C)、LPS诱导刺激下均有表达上调,对负责GCRV吸附宿主细胞的VP7具有抑制作用。本研究结果为进一步深入探讨Viperin在草鱼抗GCRV的作用机制奠定了理论基础。
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