论文部分内容阅读
血脂紊乱作为一种常见的代谢性疾病,与动脉粥样硬化性心血管疾病（arteriosclerotic cardiovascular disease,ASCVD）的发生发展密切相关。在临床工作中,即使对于心血管疾病的危险因素进行积极控制,仍会有部分患者出现大血管或微血管疾病,这就是所谓的心血管剩留风险。这种心血管剩留风险主要与高TG血症有关,通过有效的手段降低TG水平则可以极大的减少心血管疾病的患病风险。在TG代谢过程中,载脂蛋白（apolipoproteins,Apos）发挥着重要作用,其中ApoCⅢ可以通过多种途径影响TG的正常代谢过程,导致血脂紊乱。多项临床试验已经证实ApoCⅢ水平较高的个体容易发生动脉粥样硬化,而控制ApoCⅢ水平则是防治高脂血症及心血管疾病的有效手段。但是目前仍没有专门针对ApoCⅢ的治疗手段。ApoCⅢ主要在肝脏中产生,合成及分泌过程会明显受到饮食因素的影响,因此改变饮食结构将是调控ApoCⅢ水平的重要途经。白藜芦醇（resveratrol,Res）是一种最早在白藜芦中被发现的多酚化合物,后来在葡萄和虎杖等多种植物中均可检测到,截至目前已经发现它具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗动脉粥样硬化及调节脂质代谢等多种作用。不过白藜芦醇是否可以通过影响ApoCⅢ的表达来调节脂质代谢过程仍不明确。本实验拟进行高脂餐试验来评估受试者的餐后TG代谢情况,比较不同脂代谢人群间ApoCⅢ水平的差异。同时通过高脂小鼠模型和细胞模型了解高脂环境对于肝脏ApoCⅢ表达水平的影响;观察白藜芦醇是否可以通过影响ApoCⅢ的表达从而调节脂质代谢过程,为血脂紊乱及心血管疾病的防治提供新的思路。第一部分ApoCⅢ水平与餐后高甘油三酯血症的相关性研究目的:通过分析高脂餐前后血清脂蛋白及ApoAⅠ、ApoB、ApoCⅡ、ApoCⅢ水平,探讨引起餐后高TG血症的可能机制。方法:选取143名空腹TG水平正常的志愿者作为研究对象。所有受试者于清晨空腹状态下进食高脂餐,并在空腹及餐后2、4、6小时抽取静脉血测定脂代谢相关指标。将餐后任意时间点TG≥2.5mmol/L作为餐后高TG血症的判定标准。根据高脂餐试验的结果,将受试者分为两组:①餐后TG正常组（postprandial normal triglyceride,PNT）;②餐后高 TG 血症组（postprandial hypertriglyceridemia,PPT）。比较两组人群空腹及高脂餐后血浆脂蛋白及 ApoA Ⅰ、ApoB、ApoCⅡ、ApoCⅢ水平的变化。结果:1.空腹指标的比较。餐后高TG组空腹的胰岛素、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C、non-HDL-C、TRLR、ApoB、ApoCⅢ水平和 ApoC Ⅱ/ApoCⅢ比值要高于餐后TG正常组,而ApoA Ⅰ/ApoB 比值低于餐后TG正常组,差异有统计学意义。2.进食高脂餐后血脂及载脂蛋白水平的比较。PPT组高脂餐后各时间点的TG、TC、LDL-C、non-HDL-C、TRLR、ApoB和ApoCⅢ水平均高于PNT组,差异具有统计学意义。PNT组人群餐后TG水平在进食后2小时达到高峰,而PPT组餐后TG高峰在餐后4小时到达,并且峰值高于PNT组。在进食高脂餐后6小时内,两组人群的TRLR水平均逐渐升高。PPT组TG和TRLR曲线下面积的增长量都要高于PNT组（P＜0.001）。PNT组ApoCⅢ在进食2小时后达到高峰,随后逐渐降低;而PPT组ApoCⅢ水平在进食后6小时内逐渐升高,并且PPT组ApoCⅢ曲线下面积的增长量高于PNT组（P＜0.001）。3.ApoCⅢ与其余指标的相关性和回归分析。空腹ApoCⅢ水平与年龄、收缩压、舒张压、BMI、腰围、TC、TG、LDL-C、non-HDL-C、TRLR 和 ApoB 呈正相关（P＜0.05）。在校正了年龄、性别、BMI、腰围、TC、LDL-C和ApoB等因素后,ApoCⅢ为餐后高TG血症的独立危险因素（P＜0.001,OR=1.188）。小结:ApoCⅢ表达增加可能是餐后高甘油三酯血症的重要原因。第二部分 白藜芦醇对高脂饮食小鼠肝脏ApoCⅢ表达水平的影响目的:使用高脂饲料喂养C57BL/6J小鼠,观察高脂饮食对小鼠肝脏中ApoCⅢ表达水平的影响以及白藜芦醇的干预效果。方法:将C57BL/6J小鼠随机分为对照组（Con）和高脂组（HFD）。用高脂饲料喂养HFD组小鼠,8周后从HFD组中随机抽取8只给予白藜芦醇（60 mg/kg/d）灌胃,并将其编为高脂+白藜芦醇组（HFD+Res）,Con和HFD组给予相应体积的0.9%氯化钠溶液灌胃。干预8周后,处死小鼠并留取血清和肝脏组织标本进行相关检测。通过血糖仪检测小鼠空腹血糖水平,用生化法测得血脂,用酶联免疫吸附法测得胰岛素水平。对肝脏组织进行H＆E染色和油红O染色来观察其形态学变化。通过实时聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测 ApoCⅢ、转录因子 Fox O1、HNF-4α、PGC-1β和PPARα蛋白和mRNA的水平。结果:1.白藜芦醇干预8周各组小鼠一般指标的变化HFD组小鼠的体重明显高于Con组,而HFD+Res组体重与HFD组相比无明显变化。此外,HFD组小鼠的空腹血糖水平也明显升高Con组,而HFD+Res组的血糖要低于HFD组,差异有统计学意义（P＜0.05）。经过高脂喂养的小鼠胰岛素水平高于正常饮食的小鼠,而HFD+Res组和HFD组小鼠的胰岛素水平无明显差异。HFD组QUICKI值明显低于Con组,而在白藜芦醇干预后,HFD+Res组的QUICKI值有所升高（P＜0.05）,说明白藜芦醇能改善高脂饲养小鼠的胰岛素抵抗状态。2.各组小鼠血脂水平的比较与Con组相比,HFD组的TG、TC、LDL-C水平显著升高（P＜0.05）,而经过白藜芦醇干预8周后,TG、TC和LDL-C水平均明显低于HFD组（P＜0.05）。表明白藜芦醇能够在一定程度上改善小鼠血脂紊乱。3.各组小鼠肝脏组织形态学比较在H＆E染色中,Con组的肝细胞内没有见到脂滴空泡。HFD组的肝细胞整体的排列结构紊乱,而且部分细胞形态发生改变,胞浆内可见大小不等的脂滴空泡。经过白藜芦醇干预后肝细胞结构紊乱的形态有所改善,脂滴的数目也有所减少。油红O染色:Con组肝细胞中红色脂滴的数目较少,HFD组中可见大量红色的脂滴沉积,而HFD+Res组的脂滴数量介于前两者之间。4.小鼠肝脏中ApoCⅢ及各转录因子蛋白水平的变化高脂喂养的小鼠肝脏ApoCⅢ、Fox O1、HNF-4α、PPARα和PGC-1β蛋白水平明显高于Con组（P＜0.05）。经过白藜芦醇干预后,ApoCⅢ、Fox O1 和 HNF-4α水平有所降低（P＜0.05）。5.小鼠肝脏内ApoCⅢ及各转录因子mRNA水平的比较HFD组小鼠肝脏中ApoCⅢ、Fox O1、HNF-4α、PPAR α和PGC-1β的mRNA水平明显高于Con组（P＜0.05）,使用白藜芦醇之后,Fox O1、HNF-4α和 ApoCⅢ的 mRNA 水平有所降低（P＜0.05）。小结:高脂饮食可使小鼠肝脏ApoCⅢ、FoxO1、HNF-4α、PPARα和PGC-1β的表达增加;白藜芦醇干预可降低高脂饮食小鼠肝脏ApoCⅢ、Fox O1和HNF-4α的表达水平,小鼠的高血脂状态得到改善。第三部分 白藜芦醇通过影响HNF-4α和Fox O1途径减少肝细胞ApoCⅢ的表达目的:通过对HNF-4α和Fox O1的表达水平进行上调和下调,在细胞水平上验证白藜芦醇是否通过影响HNF-4α和Fox O1的表达水平来抑制ApoCⅢ的表达。方法:用 0.25 mmol/L 的棕榈酸（Palmitic acid,PA）孵育 HepG2细胞,孵育24小时后的对细胞进行油红O染色。不同浓度的白藜芦醇:100 μM、50 μM、40 μM、30 μM、20 μM 和 10 μM 干预细胞,干预1天后计算各组细胞的存活率。将HepG2细胞分为对照组（Con）、PA干预组（PA）、PA+Res 20 μM组（PA+Res）,进行相应干预处理24小时后进行RT-PCR和Western blot检测ApoCⅢ以及转录因子 Fox O1、HNF-4α、PGC-1β和 PPARα的表达水平。使用siRNA敲低Fox O1,将细胞分为对照组（Con）、PA干预组（PA）、Fox O1-阴性对照组（siRNA-NC）、Fox O1-敲低组（siRNA-Fox O1）、PA+Fox O1-敲低组（PA+siRNA-Fox O1）。使用 siRNA转染细胞24小时后进行高脂干预,干预24小时后提取RNA和蛋白,进行RT-PCR和Western blot检测。然后使用同样的方法敲低HNF-4α重复上述步骤。使用携带着Fox O1基因的质粒来转染HepG2细胞使细胞过表达Fox O1,将细胞分为对照组（Con）、Fox O1阴性对照组（P1-NC）、过表达Fox O1组（Pl-Fox O1）、过表达FoxO1+白藜芦醇30 μM组（Pl-Fox O1+Res 30 μM）、过表达 Fox O1+白藜芦醇 20 μM 组（Pl-Fox O1+Res 20 μM）和过表达 Fox O1+白藜芦醇 10 μM 组（Pl-Fox O1+Res 10 μM）,转染24小时后进行白藜芦醇干预,干预24小时后提取RNA和蛋白,RT-PCR和Western blot检测方法同前。通过同样的方法过表达HNF-4α基因重复上述步骤。结果:1.油红O染色结果Con组HepG2细胞胞浆呈淡蓝色,PA组可见大量红色脂滴,提示HepG2细胞在PA孵育下会出现严重的脂质沉积,PA+Res组的脂滴数量介于前两者之间。2.白藜芦醇细胞毒性试验Con组细胞存活率为96.6%,白藜芦醇浓度分别为100 μM、50 μM、40 μM、30 μM、20 μM和10 μM,干预24h后细胞存活率分别为52.6%、83.7%、83.1%、92.4%、93.0%和95.1%。提示高浓度的白藜芦醇对细胞具有杀伤作用。3.细胞水平上ApoCⅢ及相关转录因子蛋白水平变化PA 组 Fox O1、HNF-4α、PPARα和 PGC-1β水平明显高于 Con 组,ApoCⅢ水平也高于Con组（P＜0.05）。而在白藜芦醇的作用下,PA+Res组的Fox O1和HNF-4α水平较PA组有所降低,ApoCⅢ水平也随之下降（P＜0.05）。4.细胞水平上ApoCⅢ及各转录因子mRNA水平的比较PA 组细胞中 ApoCⅢ、Fox O1、HNF-4α、PPARα和 PGC-1β的mRNA水平明显高于Con组（P＜0.05）。白藜芦醇干预后,PA+Res组的Fox O1、HNF-4α和ApoCⅢ的mRNA水平较PA组均有所降低（P＜0.05）。5.敲低Fox O1基因后ApoCⅢ mRNA和蛋白水平的变化与Con组相比,PA组的Fox O1和ApoCⅢ mRNA和蛋白水平明显升高,siRNA-Fox O1组的Fox O1和ApoCⅢ的mRNA和蛋白水平有所降低（P＜0.05）,而siRNA-NC组与Con组之间比较无差异。经过PA干预后siRNA-Fox O1组的Fox O1和ApoCⅢ的mRNA和蛋白水平也低于PA组（P＜0.05）。这说明Fox O1可以上调ApoCⅢ的表达,敲低Fox O1基因后可以使ApoCⅢ水平降低。6.敲低HNF-4α基因后ApoCⅢ mRNA和蛋白水平的变化PA组的HNF-4α和ApoCⅢ mRNA和蛋白水平高于Con组,经过siRNA-HNF-4α干预后的HNF-4α和ApoCⅢ的mRNA和蛋白水平明显低于Con组（P＜0.05）,而siRNA-NC组与Con组相比无差异。PA干预后的siRNA-HNF-4α组的HNF-4α和ApoCⅢ的mRNA和蛋白水平也低于PA组（P＜0.05）。这同样证实HNF-4α可以上调ApoCⅢ的表达,敲低HNF-4α基因后可以使ApoCⅢ水平降低。7.白藜芦醇对于过表达Fox O1基因的HepG2细胞蛋白及mRNA水平的影响经过Pl-Fox O1干预后的HepG2细胞的Fox O1水平明显升高,ApoCⅢ水平也高于Con组（P＜0.05）。而在白藜芦醇的作用下,Pl-Fox O1+Res组的Fox O1和ApoCⅢ蛋白及mRNA水平较Pl-Fox O1组有所降低（P＜0.05）,并且与白藜芦醇的浓度有关,30 μM的作用要强于10 μM的。提示白藜芦醇可以通过影响Fox O1来下调ApoCⅢ的表达。8.白藜芦醇对于过表达HNF-4α基因的HepG2细胞蛋白及mRNA水平的影响Pl-HNF-4α组的HNF-4α和ApoCⅢ蛋白及其表达水平较Con组有所升高,而在白藜芦醇的作用下,Pl-HNF-4α对HNF-4α和ApoCⅢ蛋白和mRNA水平的影响有所减弱（P＜0.05）,Pl-HNF-4α+Res各组的HNF-4α和ApoCⅢ水平均低于Pl-HNF-4α组,并且30 μM的白藜芦醇作用要强于10 μM。说明白藜芦醇可以通过影响HNF-4α来下调ApoCⅢ的表达。小结:白藜芦醇通过抑制HNF-4α和Fox O1的表达来降低HepG2细胞中ApoCⅢ的表达水平,并且30 μM的白藜芦醇的抑制作用较强。结论:1.ApoCⅢ水平升高可能是餐后高甘油三酯血症的重要原因;2.白藜芦醇可通过抑制肝脏ApoCⅢ的表达而改善血脂紊乱,降低高TG血症;3.白藜芦醇影响肝脏ApoCⅢ表达的重要机制是减少转录因子HNF-4α和Fox O1的表达。