研究背景及目的:乳腺癌作为女性所罹患恶性肿瘤中最常见的病种之一,约占所有恶性肿瘤的30%。尽管包括手术、放疗、化疗和内分泌治疗在内的综合治疗显著降低了早期死亡率,但乳腺癌仍然是女性癌症死亡最常见原因中的第二位。恶性肿瘤的发生是由多种致癌因素引起的,其特点是细胞增殖失控和远处转移。骨是晚期乳腺癌最常见的转移部位,据报道发生率约为60-80%,骨转移大大增加了病理性骨折和脊髓压迫等并发症,严重影响生活质量。鉴于晚期乳腺癌患者发生骨转移的后续治疗策略及疗效较为有限。故探明乳腺癌骨转移的分子生物学机制,寻求新的药理学靶点,对患者的预后意义重大。微纤维相关蛋白5(Microfibrillar-associated protein 5,MFRP5)也称为微纤维相关糖蛋白2(microfibril-associated glycoprotein 2,MAGP2),是细胞外弹性微纤维的一个组成部分,在骨骼生长、心血管发育、肺泡弹性发育和马凡综合征中发挥重要作用。研究表明,MFAP5由骨髓间充质基质细胞(Bone marrow mesenchymal stromal cell,BMSC)分泌,并在造血和免疫系统中发挥作用,而MFAP5的缺失可预防小鼠骨质疏松。这些结果表明MFAP5在骨微环境中的关键作用。最近的研究进一步表明,MFAP5在头颈部恶性肿瘤、胰腺癌、肺癌和舌癌中过度表达,但是MFAP5在这些肿瘤中的作用仍有待阐明。已有研究表明,血清MFAP5水平与卵巢癌患者预后负相关,而癌细胞分泌的MFAP5能够促进肿瘤增殖,内皮细胞迁移,肿瘤血管生成和化疗药物耐药。然而,课题组成员经过文献检索,发现关于MFAP5在乳腺癌骨转移中作用机制的文献尚属少数。由于MFAP5在恶性肿瘤和骨微环境中的重要作用,我们设计实验,想进一步了解MFAP5在乳腺癌骨转移中的作用。在本研究中,我们首先验证了MFAP5在乳腺癌骨转移灶中的高表达,并探究了MFAP5对乳腺癌肿瘤细胞增殖和迁移的影响,并进一步探讨了可能的分子机制,特别是ERK/MMP信号通路。研究方法:我们的研究采用在海军军医大学附属长征医院收集的乳腺癌原发病灶、癌旁正常组织及骨转移组织。首先,我们进行MFAP5的免疫组化染色,随后通过western blot及q R-T PCR实验,分别在蛋白水平和m RNA水平验证MFAP5的表达。第二部分的实验中,我们首先构建MFAP5过表达质粒,并通过PCR扩增的MFAP5的密码序列插入pcDNA3.1+质粒中。一方面进行CCK8实验:在含10%胎牛血清的DMEM培养基中常规培养两珠乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231,细胞用DNA转染试剂或si RNA转染质粒。用过表达质粒或si RNA转染的MCF7和MDA-MB-231细胞以每孔5×103的起始密度接种在96孔板中,48h后使用细胞计数试剂盒进行计数,使用酶标仪在450nm处测量吸光度来测量结果。随后,我们使用8-μm孔径的transwell室进行transwell迁移试验。消化并计数用过表达(OE)质粒或si RNA转染的MCF7和MDA-MB-231细胞。为进一步研究MFAP5调控乳腺癌骨转移的分子机制,我们进行western blot实验,研究MFAP5与MMP2,MMP9,p-FAK,FAK,p-Erk1/2,Erk1/2,p-c Jun(Ser63),p-c Jun(Ser73),c Jun之间表达的相互影响及关系。实验中,均使用SPSS 19.0统计软件进行统计分析。数据格式为平均值±标准差,数据比较使用独立样本t检验。所有实验均重复3次,并纳入代表性结果。p<0.05被认为是有统计学意义的。结果:IHC显示MFAP5主要在细胞间隙中表达,并且在骨转移灶中的表达显著高于原发灶。western blot检测进一步证实MFAP5在骨转移中的表达高于原发灶。此外,q RT-PCR检测结果显示,在乳腺癌骨转移灶中MFAP5的m RNA水平显著高于原发灶(p<0.05)。MFAP5在MDA-MB-231细胞中MFAP5的表达水平最高,在MCF7细胞中最低。Western blot实验证实了过表达质粒和si RNA分别对MFAP5的表达起到促进及抑制作用。MCF7和MDA-MB-231细胞中进行的CCK8实验显示,MFAP5过表达后细胞活力明显增强,而抑制MFAP5后细胞增殖明显下调,表明MFAP5介导乳腺癌的细胞增殖。Transwell实验显示,MFAP5过表达的细胞迁移能力明显增强,而抑制MFAP5后,细胞迁移能力显著降低。这些结果提示MFAP5可能通过增强细胞的迁移能力而促进乳腺癌的转移。在MCF7和MDA-MB-231细胞中,MFAP5过表达时MMP2和MMP9的m RNA水平显着增高,而MMP7和MMP14的m RNA水平几乎不变。Western blot进一步表明,与OE-Ctrl质粒相比,转染OE-MFAP5质粒的MMP2和MMP9的表达显著上调,相反,si RNA对MFAP5的抑制则明显抑制了MMP2和MMP9的表达。这些结果表明MFAP5可能通过调节MMP2和MMP9的表达在乳腺癌骨转移中发挥作用。MFAP5的过表达对FAK,Erk1/2和c Jun的表达无明显影响,但MFAP5明显激活了FAK,Erk1/2和c Jun的磷酸化。相反,通过si RNAs抑制MFAP5的表达则明显抑制了p-FAK,p-Erk1/2和p-c Jun的表达。这些结果提示MFAP5可能通过ERK信号通路调控MMP2和MMP9的表达。结论:通过本研究,我们首先报道了乳腺癌骨转移灶中MFAP5表达水平相比原发灶的明显上调,并进一步发现MFAP5过表达加速了乳腺癌细胞的增殖和迁移,而当MFAP5被抑制时则呈现相反的效果。此外,MFAP5能够能激活ERK信号通路,增加MMP2和MMP9的表达,相反,抑制MFAP5的表达后,MMP2、MMP9、p-FAK、p-Erk1/2和p-c Jun的表达也受到抑制。这些结果表明MFAP5作为癌基因在乳腺癌骨转移中发挥作用,希望通过我们的研究能够找到乳腺癌骨转移新的诊断和治疗方法。