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目的:正畸牙齿移动的生物学基础是骨改建,影响牙槽骨改建的因素很多,机械力是其中至关重要的因素之一。骨髓间充质干细胞(BMMSCs)受到机械力刺激后进行增殖和分化,其对正畸牙齿移动和正畸后保持具有重要意义。本实验从细胞分子水平着手,进一步探讨应力作用下介导大鼠骨髓间充质干细胞增殖分化的信号通路及其作用机制,为临床治疗寻求更加科学合理的正畸治疗手段提供理论依据。方法:1.全骨髓贴壁法获取大鼠原代骨髓间充质干细胞,细胞纯化后进行形态学观察,通过细胞计数绘制生长曲线,流式鉴定细胞表面抗原。2.构建大鼠BMMSCs体外培养-张应力加载模型,对BMMSCs加载频率为1Hz,应力拉伸变形幅度为5%的周期性张应力,分别持续0h、3h、6h、9h、12h。应用Western blot和q RT-PCR分别检测各组细胞在不同应力加载时间下成骨相关因子RUNX2、BMP2以及转录因子Twist、E2A、p21的蛋白和m RNA表达变化。3.针对大鼠p21基因序列设计合成四个sh RNA oligo序列和一个阴性对照序列,插入到慢病毒载体中构建慢病毒表达质粒,转化至感受态细胞进行测序鉴定。慢病毒包装后收集浓缩病毒原液并进行病毒滴度的测定。用包装好的四组p21-sh RNA慢病毒以及阴性对照慢病毒分别以感染复数MOI=100感染大鼠BMMSCs,q RTPCR检测慢病毒载体对p21基因的干扰效果。选择沉默效果最佳的慢病毒和阴性对照慢病毒分别感染BMMSCs构建稳定株。4.设置空白细胞组(WT),p21基因沉默组(p21-sh RNA),阴性对照组(NC),流式细胞分析检测细胞周期,q RT-PCR分析不加力时沉默p21对转录因子Twist、E2A和成相关因子RUNX2、BMP2、Osterix的转录的影响。对三组细胞施加1Hz,5%,9h的周期性张应力,应用Western blot和q RT-PCR分别检测加载周期性张应力后沉默p21的大鼠BMMSCs成骨相关因子RUNX2、BMP、Osterix以及转录因子Twist、E2A的蛋白和m RNA表达变化,探究力学刺激介导大鼠BMMSCs的成骨分化的作用机制。结果:1.全骨髓贴壁法可获得大鼠BMMSCs,通过体外贴壁培养、传代扩增后,细胞生长逐渐稳定,细胞形态呈现均一的长梭形。传至第3~5代的BMMSCs密度分布均匀,呈现有序的成纤维细胞样形态。P1、P3、P7代细胞的生长周期均分为潜伏期、对数生长期和生长平台期,但早期传代(P1、P3代)的细胞增殖速度一直高于晚期传代(P7代)的增殖速度。流式细胞仪检测结果表明细胞表面抗原CD44、CD90、CD105呈阳性,而CD4、CD45结果呈阴性,上述结果与大鼠骨髓间充质干细胞表面特异性抗原一致。2.加载1Hz,5%的周期性张应力之后,随着加力时间增加,BMP2(**P﹤0.01)、Runx2(**P﹤0.01)均呈现时间依赖性增加的趋势,转录因子TWIST(*P﹤0.05)、p21(**P﹤0.01)也呈现时间依赖性增加的趋势,而转录因子E2A(***P﹤0.001)的m RNA和蛋白表达则随时间增加而降低。说明周期性张应力能够促进大鼠BMMSCs的成骨分化,同时影响转录因子的的表达。3.经过比对,重组慢病毒中插入的片段序列与设计的oligo序列完全一致,p21 RNA干扰慢病毒载体构建成功。病毒滴度为5×108 TU/ml,转染BMMSCs效率大于80%。4.相较WT组和NC组,p21-sh RNA组的S期细胞比例明显增加,G1+S期细胞也增多,G1、G2期细胞比例减少。沉默BMMSCs的p21基因可以引起转录因子Twist的m RNA相对表达量少量降低(*P﹤0.05),E2A的m RNA少量升高(*P﹤0.05),成骨相关因子BMP2(*P﹤0.05)、Runx2(**P﹤0.01)、Osterix(**P﹤0.01)的m RNA相对表达量在p21-sh RNA组均少于WT组和NC组。5.对WT组、p21-sh RNA组、NC组三组细胞加载1Hz,5%,9h的周期性张应力之后,q RT-PCR的结果显示,沉默p21后,转录因子Twist(**P﹤0.01)的m RNA表达受到抑制,E2A(***P﹤0.001)的m RNA表达被大大促进;成骨因子Runx2(**P﹤0.01)、Osterix(***P﹤0.001)的m RNA表达在p21被抑制后出现升高的趋势,而BMP2(*P﹤0.05)随着p21的沉默表出现降低的趋势。上述因子的蛋白结果与q RT-PCR的趋势一致。结论:1.周期性张应力促进体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化,并影响转录因子Twist/E2A/p21的表达。2.p21在维持周期性张力诱导成骨相关因子BMP2和Runx2-Osterix表达的相对平衡中起着重要的作用。3.周期性张应力诱导大鼠BMMSCs成骨分化过程中,Twist、E2A和p21之间并不是简单的线性调节,p21可以反馈调节Twist和E2A的表达。