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前言子宫内膜癌是发病率最高的女性盆腔生殖道肿瘤之一,有关其病因学研究长期以来一直是热点和重点问题,但到目前为止子宫内膜癌发生的确切机制仍不清楚。磷酯酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3—kinase,PI3K）家族是一类特异性地催化磷酯酰肌醇（phosphatidyl inositol,PI）32位羟基磷酸化,产生具有第二信使作用的肌醇脂物质的激酶。PI3K-p110β作为Ⅰ类PI3K的催化亚单位之一,广泛表达于哺乳动物的细胞,在肿瘤的形成和发展中发挥着重要的作用。然而,PI3K-p110β在人增殖期子宫内膜、子宫内膜非典型增生及子宫内膜样腺癌组织中的表达情况及其作用尚不清楚。本实验从研究PI3K-p110β、Akt及Bad在增殖期子宫内膜、子宫内膜非典型增生及子宫内膜样腺癌组织中的表达情况入手,利用RNA干扰（RNA interfence,RNAi）技术抑制了子宫内膜癌1shikawa细胞中PI3K-p110β的表达,通过RT-PCR、流式细胞仪技术等探讨它对子宫内膜癌细胞凋亡的影响。目的1、检测PI3K-p110β、Akt及Bad在增殖期子宫内膜、子宫内膜非典型增生及子宫内膜样腺癌组织中的表达情况,探讨上述三个指标在子宫内膜癌发生发展中的作用。2、通过RNAi探讨PI3K-p110β对子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡的影响。材料与方法一、研究对象与主要试剂1、研究对象增殖期子宫内膜、子宫内膜非黄型增生及子宫内膜样腺癌组织;Ishikawa细胞系。2、主要试剂鼠抗人PI3K-p110β多克隆抗体,购自Abcam公司。羊抗人Akt多克隆抗体,购自北京中杉金桥生物技术有限公司。兔抗人Bad多克隆抗体,购自武汉博士德生物工程有限公司。Lipofectamine TM2000（Invitrogen公司）Hoechst33342/PI细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术研究所）二、研究方法1、免疫组化SP法分析PI3K-p110β、Akt及Bad在增殖期子宫内膜、子宫内膜非典型增生及子宫内膜样腺癌组织中的表达情况。2、Western blot分析PI3K-p110β、Akt及Bad在增殖期子宫内膜、子宫内膜非典型增生及子宫内膜样腺癌组织中的表达情况。3、构建PI3K-p110βsiRNA的表达载体,并转染Ishikawa细胞。4、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析转染前后Ishikawa细胞中PI3K-p110β的表达情况。5、利用流式细胞技术（Hoechst33342/PI双染检测法）分析转染前后Ishikawa细胞的凋亡变化。结果1、通过免疫组化SP法研究PI3K-p110β及Akt在增殖期子宫内膜、子宫内膜非典型增生及子宫内膜样腺癌组织中的表达,结果显示二者均主要在胞质内表达,与增殖期子宫内膜组织相比较,子宫内膜样腺癌组织中的表达量明显增高（P＜0.05）。采用Western blot分析PI3K-p110β及Akt的表达量,结果与免疫组化图像分析的结果一致,在不同类型的子宫内膜组织中PI3K-p110β及Akt蛋白的表达差异具有统计学意义（P＜0.05）。2、通过免疫组化SP法研究Bad在增殖期子宫内膜、子宫内膜非典型增生及子宫内膜样腺癌组织中的表达,结果显示Bad主要在胞质内表达,与增殖期子宫内膜组织相比较,子宫内膜样腺癌组织中的表达降低（P＜0.05）。采用Western blot分析Bad的表达量,结果与免疫组化图像分析的结果一致,在不同类型的子宫内膜组织中Bad蛋白的表达差异具有统计学意义（P＜0.05）。3、构建三对siRNA重组质粒pGCsilencer TMU6/Neo/GFP/PI3K-p110βsiRNA,应用真核转染技术成功的将上述三对重组质粒及阴性对照质粒转染子宫内膜癌细胞系Ishikawa。4、通过RT-PCR方法检测pGCsi-PI3K-p110β1、pGCsi-PI3K-p110β2、pGCsi-PI3K-p110β3对Ishikawa细胞中PI3K-p110βmRNA的表达抑制率,分别为88.90%、70.19%和96.43%。干扰组与对照组分别比较,抑制率明显增高。5、通过流式细胞技术（Hoechst33342/PI双染法）检测转染pGCsi-PI3K-p110β1、pGCsi-PI3K-p110β2、pGCsi-PI3K-p110β3的Ishikawa细胞凋亡率,分别为18.3%、12.2%和14.1%,同转染了pGCsi-neg组、脂质体对照组和空白对照组相比,凋亡明显增高。结论1、PI3K-p110β在子宫内膜样腺癌组织中高表达,提示PI3K-p110β在子宫内膜样腺癌的发生发展中可能发挥着重要作用。但在不同手术病理分期和不同组织病理学分级的子宫内膜样腺癌组织中PI3K-p110β表达无显著性差异。2、RT-PCR技术证实siRNA-PI3K-p110β在mRNA水平抑制了PI3K-p110β的表达。3、流式细胞技术提示重组siRNA-PI3K-p110β可诱导肿瘤细胞凋亡。