登革病毒(dengue virus,DV)属于黄病毒家族(Flaviviridae),是一种有包膜的单链RNA病毒,它包括四种不同的血清型,分别为DV1、DV2、DV3和DV4。登革病毒感染引起的症状较为复杂,从没有明显或者是仅有轻度症状的登革热(classical dengue fever,DF),到病势凶险伴有多种综合症状的登革出血热和登革休克综合征(dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome,DHF/DSS)。在过去的几十年中,该病毒以埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(A. albopictus)为媒介昆虫,在全世界热带和亚热带地区大面积流行,据世界卫生组织报道,每年全世界有近1亿人感染DV,其中以与我国接壤的东南亚地区流行最为严重。DV感染已经成为一个越来越严重的公共卫生问题,它正时刻威胁着人类的健康。但遗憾的是,迄今为止DF和DHF/DSS的致病机制尚未完全阐明。在对DV感染的神经元、蚊、非洲绿猴肾等多种细胞的超显微观察中,研究人员发现病毒颗粒主要分布于粗面内质网腔、来源于粗面内质网的囊泡以及高尔基体区域。在正确组装病毒的核衣壳并获得包膜和其它附属结构后,一部分病毒被转运到高尔基体中逐步成熟并最终通过胞吐途径释放到细胞外。作为严格的胞内寄生物,DV利用宿主本身的合成和运输系统完成自身的感染过程。因而,寻找可能参与病毒大分子生物合成、病毒颗粒成熟和运输过程的宿主因子的研究备受关注。因为这些问题的阐明不仅有助于我们理解DV的感染过程,同时可能为进一步研制抗DV药物提供新的靶点。Rab蛋白是Ras超家族中的一类,也是一类低分子量的GTP结合蛋白(大约20-29 kDa),它们负责调控真核细胞的囊泡运输等过程。其中,Rab8分布于反面高尔基体网络、囊泡和细胞膜,主要调控从高尔基体到细胞膜的囊泡运输。它参与了多种胞内合成蛋白的运输和分泌,比如说黑色素体依赖于肌动蛋白(actin)的运输等。在Rab8缺陷的小鼠中,小肠表面的一些肽和载体蛋白错误地定位到胞内的溶酶体,导致小肠对营养的吸收功能受到严重影响。因此,Rab8参与了细胞膜和膜蛋白的生物合成和运输过程,其异常功能状态不仅影响胞吐过程还会影响到胞吞过程。所以我们假设:一方面,因为DV颗粒在内质网到高尔基体区域成熟,所以病毒很可能会利用同样在这一区域的Rab8来完成其组装和运输,实现其胞吐释放的过程;另一方面,DV进入细胞必须的DV受体或者其他与DV内吞相关的细胞成分也需要依靠Rab8实现正确的分泌和定位。肌动蛋白所介导的囊泡运输主要依赖于Rab8的活性,所以Rab8有可能参与调控囊泡在细胞骨架上运输的马达蛋白的招募过程。肌球蛋白Ⅴ(MyosinⅤ)是介导肌动蛋白运输最有效的一类马达蛋白,其中,肌球蛋白Ⅴc(MyosinⅤc,Myo5c)是2002年发现的该家族中的新成员。研究发现,Myo5c可以和某种带有Rab8的囊泡共存;当其负突变——Myo5c tail在胞内表达时,转铁蛋白堆积在一些细胞区室中,提示Myo5c可能参与人体内某些重要组织和器官中肌动蛋白介导的膜运输过程。而我们在以前的研究中也发现肌动蛋白参与DV2感染的过程。因此推测:Myo5c作为一种肌动蛋白的马达蛋白,可能直接或通过Rab8参与DV2感染过程。虽然肝脏并不是DV感染的主要靶器官,但是在一些DV感染的临床病例以及尸检中都证实,有病毒抗原存在于肝脏细胞和Kupffer氏细胞,并伴随有肝功能异常。而且还有报道表明,DV可以在HepG2细胞系中复制,随后形成有侵染能力的病毒颗粒会被释放到培养液上清当中。故本文以HepG2细胞为研究对象,探讨Rab8和Myo5c在DV感染中的作用。本研究的主要结果和结论如下:一、Rab8截短体蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备首先,采用RT-PCR方法从HepG2细胞总RNA中T-A克隆了人Rab8基因,构建了pMD19T-Rab8质粒,针对Rab8蛋白的C端122个氨基酸设计一对亚克隆引物,以pMD19T-Rab8质粒为模板,用PCR扩增和BamHⅠ/HindⅢ双酶切方法将Rab8-122的DNA片段定向亚克隆到原核表达载体中,构建了原核表达质粒pQE31-Rab8-122。该质粒经双酶切和测序检验构建的准确性。随后,对含有pQE31-Rab8-122质粒的工程菌诱导表达,1 mM IPTG诱导4 h即可获得以包涵体形式表达的目标蛋白。用Ni亲和层析、pH梯度洗脱和透析的方法纯化目标蛋白。用抗His抗体可以检测到Western blot反应膜上的目标蛋白,其大小约为15 kDa,与预期大小一致。最后,用获得的Rab8截短体蛋白免疫动物制备抗Rab8多克隆抗体。经ELISA检测,制备的抗血清效价达1∶20000。Western blot实验证明,1∶500稀释的自制兔抗Rab8抗体,能够与诱导表达的6×His-Rab8-122蛋白以及HepG2细胞中分子量约为24 kDa的内源性Rab8蛋白发生特异的抗原抗体反应。Rab8抗血清的成功制备为后续研究奠定了基础。二、Myo5c截短体蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备首先,根据Myo5c特异性的α-螺旋区设计引物,采用RT-PCR方法从人胃黏膜组织总RNA中获得目标片段,用BamHⅠ/ SalⅠ双酶切方法将Myo5c-297片段的DNA编码序列定向克隆到原核表达载体,构建了原核表达质粒pQE31-Myo5c-297。该质粒经双酶切和测序检验构建的准确性。用1 mM IPTG对含有pQE31- Myo5c-297质粒的工程菌诱导表达。获得的目标蛋,用Ni亲和层析、pH梯度洗脱和透析的方法纯化。用抗His抗体可以检测到Western blot反应膜上的目标蛋白,其大小约为42 kDa,与预期大小一致。最后,用获得的Myo5c截短体蛋白免疫动物制备抗Myo5c多克隆抗体。经ELISA检测,制备的抗血清效价达1∶12800。Western blot实验证明,1∶500稀释的自制小鼠抗Myo5c抗体,能够与诱导表达的6×His-Myo5c-297蛋白以及HepG2细胞中分子量约为203 kDa的内源性Myo5c蛋白发生特异的抗原抗体反应。1:200稀释的Myo5c抗血清还能检测人结肠黏膜切片中Myo5c抗原。Myo5c抗血清的成功制备为后续研究奠定了基础。三、Rab8参与2型登革病毒复制周期1、Rab8和DV2在HepG2细胞内高度共存DV2感染HepG2细胞,胞内的Rab8分布并没有出现非常显著的改变,仍然分布于核周到细胞膜之间的区域。但是在胞内点状分布的DV2抗原位置也有明显相同点状的Rab8抗原存在。用激光共聚焦分析这些点状结构,发现Rab8与DV2高度共存,其共存率大于90 %。这提示,Rab8可能参与DV2感染细胞的过程。2、稳定表达Rab8正、负突变体HepG2细胞的建立为进一步研究Rab8在DV复制周期中的作用,我们利用脂质体法分别将pcDNA3.1、pcDNA3.1-Rab8Q67L和pcDNA3.1-Rab8T22N超纯质粒转染至HepG2细胞,经过筛选,成功地获得具有G418抗性的细胞株,分别命名为HepG2p3.1、HepG2Rab8AM和HepG2Rab8DN ,经流式细胞计数法鉴定Rab8正、负突变体在HepG2Rab8AM和HepG2Rab8DN细胞中的表达,证明所构建的细胞株可用于后续实验研究。3、表达Rab8正、负突变体导致DV2阳性细胞数减少免疫荧光染色发现:DV2感染HepG2p3.1、HepG2Rab8AM和HepG2Rab8DN细胞后24 h,大约有60%的HepG2p3.1细胞表现为病毒抗原阳性,而HepG2Rab8AM和HepG2Rab8DN细胞中则最多有20 %- 30 %的细胞呈现为病毒抗原阳性。这说明,表达Rab8正、负突变体影响到DV2感染细胞的过程。4、表达Rab8正、负突变体导致培养上清中的子代病毒的释放减少利用空斑实验,在DV感染后不同时间点检测HepG2p3.1、HepG2Rab8AM和HepG2Rab8DN细胞培养上清中病毒滴度发现:在感染后8 h,三者所产生的子代病毒没有显著变化;但在感染后24和48 h,以HepG2p3.1细胞为对照,HepG2Rab8AM细胞(表达Rab8正突变体Rab8Q67L)培养上清中子代病毒分别减少了97.0 %和82.2 %;同样HepG2Rab8DN细胞(表达Rab8负突变体Rab8T22N的)培养上清中子代病毒分别减少77.2 %和53.3 %。这表明Rab8正、负突变体的表达能够抑制子代DV的释放;且较之于Rab8负突变体, Rab8正突变体作用更为显著。5、表达Rab8正、负突变体抑制胞内侵染性病毒颗粒的产生同样利用空斑实验,在感染后8、24和48 h,检测HepG2p3.1、HepG2Rab8AM和HepG2Rab8DN细胞内病毒滴度发现:在感染后8 h,三者胞内合成的侵染性病毒颗粒没有显著变化;但在感染后24和48 h,HepG2p3.1细胞胞内的DV2颗粒随着感染时间的延长而迅速增加;与之相比较,表达Rab8正突变体Rab8Q67L分别使胞内病毒滴度降低了96.4 %和78.8 %;表达Rab8负突变体Rab8T22N也分别使胞内病毒滴度降低了86.4 %和80.2%。这表明Rab8正、负突变体的表达,能够抑制细胞内侵染性病毒颗粒的产生,Rab8可能是HepG2细胞中参与DV2成熟过程的重要宿主因子。6、表达Rab8正、负突变体能够抑制病毒RNA复制为进一步阐明表达Rab8正、负突变体使细胞内DV2产生减少的原因,在DV2感染后不同时相点,利用real-time RT-PCR方法,检测了HepG2p3.1、HepG2Rab8AM和HepG2Rab8DN细胞中DV2 NS1基因(RNA)的相对水平。我们发现感染后24和48 h,表达Rab8正突变体Rab8Q67L分别使胞内病毒RNA降低了51 %和28.5 %;表达Rab8负突变体Rab8T22N也分别使胞内病毒RNA降低了33 %和36 %。结果表明,表达Rab8正、负突变体可在一定程度下调病毒RNA复制。但是与相同时间点细胞内的病毒滴度相比较,病毒滴度的减少远比病毒RNA的减少显著,这提示表达Rab8正、负突变体可能干扰了病毒的组装,而对病毒复制的影响相对较少。7、表达Rab8正、负突变体抑制病毒进入HepG2细胞利用病毒进入的实验方法,检测了进入HepG2p3.1、HepG2Rab8AM和HepG2Rab8DN细胞的病毒颗粒数量发现:与对照相比较,表达Rab8正突变体Rab8Q67L抑制81.3 %病毒进入,表达Rab8负突变体Rab8T22N可抑制79.7%病毒进入细胞。结果表明,Rab8参与了DV2进入HepG2细胞的过程。四、Myo5c参与2型登革病毒释放1、Myo5c tail稳定表达细胞株的建立首先构建了Myo5c tail真核表达质粒pCI-Myo5c-tail,以pCI-neo空载体为对照,用脂质体法转染HepG2细胞,利用筛选培养基获得具有G418抗性的细胞株,分别命名为HepG2pCI和HepG2Myo5c-tail。Western Bolt检验结果显示,用鼠抗Myo5c抗血清可以检测到HepG2pCI和HepG2Myo5c-tail细胞中内源性的Myo5c蛋白,大小约为203 kDa,而在HepG2Myo5c-tail细胞中除了可以检测到内源性的Myo5c蛋白外还可以检测到转染pCI-Myo5c-tail质粒表达的Myo5c tail蛋白,大小约为93 kDa。说明HepG2Myo5c-tail细胞能够稳定表达Myo5c tail,所构建的HepG2pCI和HepG2Myo5c-tail细胞可以用于后续实验研究。2、HepG2细胞中Myo5c可能与Rab8存在相互关联间接免疫荧光双染色法结果表明,Rab8和Myo5c均分布于核周到细胞膜区域,共聚焦分析两者共存率在局部区域高达90 %。说明在HepG2细胞中Myo5c与Rab8高度共存。用流式细胞免疫染色计数法检测发现,HepG2Myo5c-tail细胞中内源性Rab8表达量相对于HepG2pCI细胞增加近一倍。提示Myo5c tail的表达,可能导致HepG2细胞内源性Myo5c功能受到抑制,胞内Rab8的量出现代偿性增加。3、Myo5c间接调控病毒释放间接免疫荧光双染色结果显示,在感染后24 h,Myo5c和DV2抗原虽然均出现在核周和胞浆内,但共聚焦分析表明两者共存率很低,提示Myo5c和DV2之间可能不存在直接的相互作用关系。利用空斑实验,检测感染后不同时相点HepG2pCI和HepG2Myo5c-tail细胞细胞内外病毒滴度的变化发现:与对照HepG2pCI细胞比较,在感染后8、24和48 h,HepG2Myo5c-tail细胞培养上清中子代病毒分别减少了32.5 %、39.4%和47.3 %,而细胞内病毒滴度无明显变化。表明表达具有负突变效应的Myo5c tail,在一定程度上抑制了子代病毒的释放,但对细胞内DV2的产生影响较小。