补肾活血方对大鼠膝骨关节炎软骨自噬和炎症的影响及临床疗效观察

来源 :广州中医药大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:w33599589
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目的:1从临床试验方面探究补肾强筋胶囊治疗肝肾不足、筋脉瘀滞型膝骨关节炎的临床疗效和安全性,以为临床应用补肾活血药治疗膝骨关节炎提供依据;2从动物实验方面构建大鼠膝骨关节炎模型,观察补肾强筋胶囊对膝骨关节炎大鼠软骨组织自噬和MAPKs相关基因和蛋白表达的影响,探讨补肾活血方对大鼠膝骨关节炎作用的可能靶向机制。方法:1临床试验纳入2018年3月~2018年11月在广东省第二中医院骨伤科门诊就诊的膝骨关节炎患者56例,按照随机数字表法将受试者随机分为试验组和对照组各28例。试验组予以口服补肾强筋胶囊,对照组予以口服塞来昔布胶囊。两组患者在口服药物的基础上均予以指导功能锻炼,疗程均为6周。分别记录两组患者治疗前、治疗1周、4周、6周的VAS评分、WOMAC评分、JOA膝骨关节炎治疗效果评定、中医证候疗效评定情况、不良事件发生情况。2动物实验将40只SD大鼠随机分为正常组(10只)、模型组(10只)、补肾强筋胶囊高剂量组(10只)、补肾强筋胶囊低剂量组(10只),除正常组外,其余各组均进行大鼠KOA造模,并进行药物干预,补肾强筋胶囊高、低剂量组按照人推荐剂量进行等效换算,分别给予0.86g·kg-1、0.243g·kg-1补肾强筋胶囊灌胃,正常组和对照组分别给予相应体积的生理盐水,每日1次,持续6周。处死大鼠,采集各组大鼠血清和膝关节软骨组织进行检测。记录膝关节解剖大体观察评分,制作病理切片,用HE染色观察各组大鼠关节组织结构的改变,并进行改良Markin评分;采用ELISA检测大鼠血清 IL-1 β、IL-6、TNF-α、PGE2 水平;用 RT-qPCR 检测 18S、IL-1 β、TNF-α、MMP1、MMP13、TIMP1、ULK1、Beclin1、LC3B、AMPK α1、mTOR、NLRP3、p38MAPK、JNK基因表达水平;用Western blot检测大鼠膝关节软骨组织iNOS、COX2、MMP1、MMP13、TIMP1、ULK1、Beclin1、AMPK、p38MAPK、JNK 蛋白表达水平。结果:1临床研究经6周治疗后,两组患者VAS评分、WOMAC疼痛指数均较治疗前有明显下降(K0.05),两组间比较,治疗1周、4周、6周时,对照组在VAS评分和WOMAC疼痛指数改善上均优于试验组(K0.05);两组患者WOMAC僵硬指数均较治疗前明显下降(P<0.05),两组间改善程度无明显差异(P>0.05);两组患者WOMAC活动功能指数均较治疗前有明显下降(P<0.05),治疗1周时,两组在WOMAC活动功能指数改善上无明显差异(P>0.05),治疗4周、6周时,试验组在WOMAC活动功能指数改善上优于对照组(P<0.05);两组患者WOMAC总指数均较之前明显下降(P<0.05),治疗1周、4周时,两组在WOMAC总指数改善上无明显差异(P>0.05),治疗6周后,试验组在WOMAC总指数改善上优于对照组(P<0.05);两组患者膝关节JOA评分均较治疗前明显改善(P<0.05),两组间改善程度无明显差异(P>0.05);试验组总有效率为92.86%,高于对照组的89.29%,但两组间比较无统计学意义(P>0.05)。两组患者不良事件发生率均较低,其中试验组为2/24,对照组为3/24,经对症处理后均好转。2动物实验6周后,各组大鼠膝关节解剖大体观察结果显示,模型组大体观察评分显著高于正常组(P<0.05),补肾强筋胶囊高、低剂量组评分显著低于模型组(K0.05);各组大鼠膝关节软骨组织HE染色结果显示,模型组软骨组织退变程度最重,补肾强筋胶囊高、低剂量组软骨组织退变程度较模型组减轻;改良Mankin评分结果显示,模型组评分显著高于正常组(P<0.05),补肾强筋胶囊高、低剂量组评分显著低于模型组(P<0.05);ELISA结果显示,模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平显著高于正常组(P<0.05),补肾强筋胶囊治高、低剂量组IL-1 β、IL-6、PGE2、TNF-α水平显著低于模型组(P<0.05);高剂量组和低剂量组相比,IL-1 β、IL-6、PGE2、TNF-α水平无明显差异(P>0.05)。RT-qPCR结果显示,与正常组相比,模型组IL-1 β、TNF-α、MMP1、MMP13、mTOR、NLRP3、p38MAPK、JNK mRNA 表达量显著升高(P<0.05),TIMP1、ULK1、Beclinl、LC3B、AMPK α1mRNA表达显著降低(P<0.05)。与模型组相比,补肾强筋胶囊高剂量组和低剂量组 IL-1β、TNF-α、MMP1、MMP13、mTOR、NLRP3、p38MAPK、JNK mRNA 表达量显著降低(P<0.05),TIMP1、ULK1、Beclin1、LC3B、AMPK α1 mRNA表达显著升高(P<0.05)。高剂量组和低剂量组相比,IL-1 β、TNF-α、MMP1、MMP13、mTOR、NLRP3、p38MAPK、JNK、TIMP1、ULK1、Beclin1、LC3B、AMPKα1 mRNA表达无明显差异(P>0.05)。Western blot结果显示,与正常组相比,模型组iNOS、COX2、MMP1、MMP13、p38MAPK、JNK 表达量显著升高(P<0.05),TIMP1、ULK1、Beclin1、AMPK 表达显著降低(P<0.05)。与模型组相比,补肾强筋胶囊高剂量组和低剂量组iNOS、COX2、MMP1、MMP13、p38MAPK、JNK 表达量显著降低(P<0.05),TIMP1、ULK1、Beclin1、AMPK表达显著升高(P<0.05)。高剂量组和低剂量组相比,iNOS、COX2、MMP1、MMP13、p38MAPK、JNK、TIMP1、ULK1、Beclin1、AMPK 蛋白表达量无明显差异(P>0.05)。结论:1临床研究部分补肾强筋胶囊可以有效减轻KOA患者VAS评分、WOMAC疼痛指数,有效改善KOA患者WOMAC僵硬、活动功能指数、膝关节JOA评分。中医证候疗效评定方面,其总有效率为92.86%,且具有良好的安全性。2动物实验部分补肾强筋胶囊可以显著降低KOA大鼠血清IL-1 β、IL-6、TNF-α、PGE2水平,降低KOA大鼠软骨组织iNOS、COX2、MMP1、MMP13、p38MAPK、JNK、NLRP3基因或蛋白表达,提升TIMP1、TIMP1、ULK1、Beclinl、LC3B、AMPK基因或蛋白表达。其可能通过激活自噬AMPK/ULK1信号通路,抑制mTOR的表达;抑制p38MAPK、JNK信号通路的表达及NLRP3的活化,从而发挥保护软骨的功效。
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