背景:急性胰腺炎是一种高发病率、高死亡率的无菌性炎症性疾病,也是一种临床常见的外科急腹症之一。重症者甚至导致全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)以及多器官功能障碍(multiple organ dysfunctions,MOD),临床病死率高达20%。迄今为止,急性胰腺炎的临床治疗也存在诸多困难,因此相关特效药物的研发成为目前的研究热点。但目前关于急性胰腺炎的发病机制仍不是十分清楚。以往的研究多集中于胰腺腺泡细胞损伤和治疗,关于胰腺导管细胞的研究并不多见。而胰腺导管细胞却是胰腺炎时最容易受到有害刺激的细胞类型。已有研究指出嘌呤受体P2X配体门控性离子通道7(P2X ligand-gated ion channel 7,P2X7),可以通过招募NOD样受体3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)与含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)组成的炎症性小体来促进炎症细胞因子白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白介素-18(interleukin-1β,IL-18)的成熟中起到了关键的作用。急性炎症时细胞外三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)通过P2Y和P2X受体调节胰腺导管功能,因此ATP活化的嘌呤能受体可能在胰腺生理,甚至在胰腺病理生理中发挥着至关重要的作用。随着现代科学的飞速发展,急性胰腺炎的诊疗越来越倾向于中西医结合的思路和模式。中医学认为急性胰腺炎急性反应期其辨证往往属阳明腑实证,腑气不通是急性胰腺炎的基本病机,不通则痛。根据“六腑以通为用”的原则,急性胰腺炎早期的中医治疗往往采用“通里攻下,清热泄泻”之法。中药大黄具有清泻湿热,凉血解毒之功效,在中医经典复方大承气汤以及清胰汤中占据君药的位置。我们前期的研究已经证实大黄中提取的天然产物——大黄素(1,3,8-三羟基-6-甲基蒽醌,Emodin)为蒽醌类衍生物,研究发现,大黄素可以通过抗炎作用对胰腺腺泡细胞发挥良好的保护作用。此外,大黄素在急性炎症中抑制炎症细胞因子的生成与释放等功能,起到了有效缓解急性胰腺炎的显著效果,但其作用机理仍不明确。因此,进一步探寻大黄素治疗急性胰腺炎的靶点及分子机制,对临床治疗急性胰腺炎意义重大。目的:本研究旨在探讨大黄素是否通过NLRP3炎症小体发挥作用,从而在大鼠体内改善急性胰腺炎炎性级联反应以及大黄素对三磷酸腺苷诱导的胰腺导管细胞体外损伤的保护作用及分子机制。方法:(1)在大黄素减轻急性胰腺炎大鼠炎症反应的体内实验中,将Sprague Dawley(SD)大鼠随机分为假手术组(SO)、急性胰腺炎模型组(AP);低剂量和高剂量大黄素治疗组(30和60mg/kg)。采用5.0%牛磺胆酸钠(sodium taurocholate,STC)经胆胰管逆行注射法诱导急性胰腺炎大鼠模型。大鼠逆行性胰胆管注射牛磺胆酸钠苏醒后的即刻以及第6小时,将大黄素通过灌胃的方式给药。造模12小时后麻醉处死模型动物,腹主动脉采血分离血浆,酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测血浆淀粉酶(amylase)、脂肪酶(lipase)、血浆IL-1β和IL-18。ELISA法检测血浆ATP浓度。最后,提取部分胰腺组织,经苏木精/伊红(H&E)染色后,光学显微镜观察组织病理学损伤及胰腺导管病理损伤,根据病理组织学评价体系对胰腺病理改变进行评分;采用免疫组化和免疫荧光法检测胰腺组织中髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)表达,部分胰腺组织制成组织匀浆液,ELISA法检测ATP浓度。提取胰腺组织总蛋白,免疫印迹分析(Western blot)检测P2X7、NLRP3、ASC和caspase-1在蛋白水平的表达情况。(2)在大黄素改善三磷酸腺苷诱导的胰腺导管细胞损伤的研究中,以人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7细胞系为研究对象,将HPDE6-C7细胞用含不同浓度梯度ATP的培养液孵育16小时,采用MTT法检测细胞活力确定造模药ATP的最佳体外刺激浓度。用含不同浓度梯度大黄素的培养液孵育细胞24小时,MTT法检测大黄素的细胞毒性并筛选最佳体外给药浓度。将HPDE6-C7细胞分为三组:空白对照组,ATP诱导模型组以及大黄素给药组。给药组细胞预先用含大黄素的培养液孵育24小时,随后更换培养液;模型组与给药组分别用用含ATP的培养液孵育16小时,收集细胞及上清液用于后续实验研究。利用光学显微镜观察不同处理组细胞形态;采用免疫荧光染色法检测细胞内P2X7蛋白的表达水平;ELISA法检测HPDE6-C7细胞上清液中的IL-1β和IL-18;提取HPDE6-C7细胞总蛋白,免疫印迹分析检测P2X7,NLRP3,ASC和caspase-1蛋白的表达。(3)在大黄素改善三磷酸腺苷诱导的胰腺导管细胞损伤的分子机制研究中,首先,分别用空载质粒和P2X7过表达质粒体外转染人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7细胞系,免疫印迹分析检测P2X7蛋白的表达以确定转染效率。随后,将HPDE6-C7细胞分为三组:第1组,空载质粒+大黄素组;第2组,P2X7过表达质粒组;第3组,大黄素+P2X7过表达质粒组。分别用空载质粒和P2X7过表达质粒体外转染细胞24小时,随后,第1组和第3组细胞用含大黄素的细胞培养液,第2组用正常细胞培养液继续孵育24小时,24小时后3组细胞同时更换为含ATP的细胞培养液继续孵育16小时,收集细胞及上清液备用。利用光学显微镜观察不同处理组细胞形态;采用免疫荧光染色法观察不同处理细胞内P2X7的蛋白表达;提取细胞总蛋白,免疫印迹分析检测P2X7,NLRP3,ASC和caspase-1蛋白的表达。采用ELISA法检测细胞上清液中IL-1β和IL-18的水平。结果:(1)在大黄素减轻急性胰腺炎大鼠炎症反应的体内实验中,HE染色观察到AP大鼠胰腺组织明显的病理损伤,大黄素可以有效减轻胰腺组织病理损伤,降低组织病理学评分。AP大鼠的血浆淀粉酶和脂肪酶水平显著升高,而与AP组相比,大黄素能以剂量依赖性的方式显著降低大鼠血浆淀粉酶和脂肪酶水平。此外,大黄素还能改善AP引起的胰腺实质细胞超微结构改变。HE染色结果却可以看到急性胰腺炎大鼠模型的胰腺导管显示出现了上皮细胞损伤、坏死,细胞排列不整齐,间隙增大,紧密连接结构被破坏。导管形态较假手术组出现明显改变,导管间相互融合。相反,大黄素治疗组胰腺导管损伤减轻。并同样呈剂量依赖性。显示了大黄素对急性胰腺炎大鼠胰腺导管上皮细胞的损伤起到了保护作用。与对照组相比,模型组大鼠血浆及胰腺组织匀浆液中ATP释放增多,而大黄素给药可以有效抑制胰腺实质细胞释放ATP,但并不降低血浆ATP水平。免疫组织化学和免疫荧光化学结果显示,与AP组相比,大黄素能够下调胰腺组织中髓过氧化物酶MPO的表达水平。我们通过免疫印迹分析观察到AP组大鼠胰腺组织中P2X7,NLRP3,ASC和caspase-1的蛋白表达较SO组显著上调,大黄素口服给药可以显著降低AP大鼠胰腺组织P2X7,NLRP3,ASC和caspase-1的蛋白表达。ELISA检测发现,与AP组相比,大黄素能显著降低大鼠血浆炎性因子IL-1β和IL-18的水平。(2)在大黄素改善三磷酸腺苷诱导的胰腺导管细胞损伤的研究中,为了选择合适的刺激浓度,通过MTT法检测不同ATP剂量处理的HPDE6-C7细胞的活力,结果显示40mM ATP在处理16小时后引起显着的细胞损伤,选择作为体外模型的刺激剂量。此外,用MTT法检测大黄素对HPDE6-C7细胞的细胞毒性,结果显示90μM大黄素具有明显的细胞毒性,但45μM大黄素的剂量可以显着增加细胞活力。使用光学显微镜观察HPDE6-C7细胞的形态,结果显示ATP显著引起HPDE6-C7细胞损伤和细胞死亡的特征性形态变化,大黄素可以保护HPDE6-C7细胞免于ATP诱导的体外损伤。荧光显微镜观察发现,ATP体外刺激可以显著增加P2X7蛋白水平,而45μM剂量的大黄素显着降低P2X7阳性细胞的数量。与对照组相比,损伤的HPDE6-C7细胞中P2X7,NLRP3,ASC和caspase-1的表达显着增加,大黄素(45μM)处理明显抑制P2X7,NLRP3,ASC和caspase-1的表达。此外,ELSIA检测发现,大黄素能够降低ATP诱导的损伤HPDE6-C7细胞上清液中的IL-1β和IL-18的水平。(3)在大黄素减轻三磷酸腺苷诱导的胰腺导管细胞损伤的分子机制研究中,与转染空载质粒的细胞相比,用P2X7过表达质粒转染后细胞内P2X7的蛋白表达显着上调。用P2X7过表达质粒预处理后,与ATP组相比,HPDE6-C7细胞的形态学损伤显着增强,但大黄素没有改善这些变化。此外,与ATP组相比,用P2X7过表达质粒预处理后,ATP诱导的HPDE6-C7细胞中P2X7阳性细胞数显著增加,且这种作用没有通过大黄素降低。因此,在用P2X7过表达质粒转染后,在存在或不存在大黄素的情况下,P2X7阳性细胞的数量都显着增加,表明P2X7过表达逆转了大黄素对P2X7表达的作用。此外,无论是否存在大黄素,用P2X7过表达质粒转染后,与对照组相比,P2X7,NLRP3,ASC和caspase-1的表达水平均显著增加。在IL-1β和IL-18的蛋白质表达水平上也观察到类似的结果。结论:大黄素有可能是一种新兴且高效的治疗急性胰腺炎候选天然产物。嘌呤受体P2X7是大黄素介导的急性胰腺炎胰腺导管细胞损伤减轻的靶点,为大黄素在未来临床治疗中的进一步发展提供了依据。