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目的(1)探讨TIGIT在人原发性肝癌患者组织和外周血中的表达及其临床意义;(2)为了进一步研究调控TIGIT的作用机制,构建miRNAs靶向TIGIT基因质粒pMIR-TIGIT-WT/mut,建立稳定过表达TIGIT的T细胞白血病细胞系(Jurkat T细胞)模型,探讨T细胞中调控TIGIT相关miRNAs的作用机制和临床意义。方法(1)免疫组织化学技术(IHC)和实时荧光定量PCR技术(qPCR)检测77例HCC患者组织中TIGIT、CD4、CD155的表达(癌组织73例,癌旁组织47例),用统计学方法分析其与临床病理特征的相关性;(2)流式细胞术检测31例HCC患者手术前后外周血CD4~+T和Treg细胞中TIGIT的表达,分析其临床意义,30例健康体检者做阴性对照;(3)液相芯片技术检测血浆中炎性细胞因子在HCC患者中的临床意义;(4)根据TIGIT的核酸序列,通过miRBase和Targetscan等软件预测靶向作用TIGIT的mi RNAs;(5)qPCR检测TIGIT相关miRNAs在HCC中的表达水平;(6)筛选出与TIGIT表达相关的miRNAs,根据其结合的靶点构建TIGIT3’-UTR野生型及突变型质粒重组体,利用双荧光素酶报告系统检测相关miRNAs与TIGIT之间的靶向作用;(7)构建稳定过表达TIGIT的Jurkat T细胞株;(8)将microRNA-up慢病毒载体,转染至过表达TIGIT的JurkatT细胞中,通过qPCR及WB检测TIGIT的mRNA及蛋白水平的变化;结果(1)IHC结果通过平均光密度(IOD)及累计阳性面积值(AREA)进行统计分析,结果显示TIGIT蛋白表达于肝索间隙浸润的淋巴细胞上,TIGIT阳性细胞多分布于汇管区及血管周围,在肝索间隙也散在浸润。在肝癌组织中,随着肿瘤细胞分化程度由高到低,TIGIT表达逐渐增加;CD155蛋白主要表达于肝癌细胞的细胞膜上,部分细胞胞浆中也有表达,在高中分化期肝癌细胞中的表达量最高。(2)qPCR结果显示,在癌组织中TIGIT、CD155mRNA明显高于癌旁组织中的相对表达量(P<0.05),在中分化期,TIGITmRNA表达水平最高;CD155 mRNA的表达水平在各分化程度没有明显的变化趋势;(3)流式细胞术检测结果显示,与健康对照相比,HCC患者术前外周血CD4~+T淋巴细胞表面TIGIT表达显著升高(P=0.001),术后没有明显变化;HCC患者术前外周血Treg细胞表面Tigit表达上调(P=0.02),术后表达下降,与健康对照相比无统计学差异。HCC患者术前外周血TIGIT+CD4+T细胞频数与AFP呈正相关(r~2=0.327,P=0.0015),HCC患者术前外周血TIGIT+Treg细胞频数与AFP呈正相关(r~2=0.592,P=0.001);(4)液相芯片技术检测血浆中炎性细胞因子在HCC患者术前及术后的分泌水平变化,与HCC患者术前炎性细胞因子的分泌水平相比,术后HCC患者血浆中促炎性细胞因子IL-17a表达升高(P=0.047),IL-6表达升高(P=0.043),抑炎性细胞因子IL-10表达减少(P=0.034)。(5)通过生物信息网站预测TIGIT3’-UTR区与miR-206,miR-143,miR-203,miR-1,miR-425可能存在靶向关系,通过qPCR检测TIGIT相关miRNAs(mir-206、mir-143、mir-1、mir-203、mir-425)在HCC患者及正常对照组中的表达水平,结果显示:miR-206,miR-143在HCC患者中表达水平显著低于正常对照组,且与TIGIT+Treg细胞的频数呈负相关。提示miR-206,miR-143能够调控TIGIT在Treg细胞上的表达介导肿瘤的免疫逃逸;(6)成功构建了靶向miR-206的TIGIT重组质粒,通过双荧光素酶检测结果显示,过表达miR-206可抑制TIGIT重组载体荧光素酶的表达,抑制miR-206表达可使TIGIT重组载体荧光素酶的表达升高。实验结果证实了miR-206与TIGIT存在靶向关系;(7)成功构建过表达TIGIT Jurkat T细胞稳定株,感染microRNA-206-up慢病毒载体后,qPCR及WB检测TIGIT mRNA及蛋白水平变化,与阴性对照组相比microRNA-206-up慢病毒载体感染组TIGITm RNA及蛋白水平降低。提示mir-206可以负向调控TIGIT的表达;结论(1)TIGIT、CD155的mRNA和蛋白水平在癌组织中的表达明显高于癌旁组织,随着肿瘤细胞分化程度由高到低,在肝癌组织中TIGIT表达逐渐增加;TIGIT~+CD4~+T细胞,TIGIT+Treg细胞频数在HCC中明显增高,提示增加的功能紊乱的CD4~+T细胞中TIGIT+Treg细胞是参与抗肿瘤免疫的重要亚群,这两类细胞频数与AFP均呈正相关关系,提示TIGIT有望成为HCC早期诊断和病情评估的潜在生物标志物;与HCC患者术前炎性细胞因子的分泌水平相比,术后HCC患者血浆中促炎性细胞因子IL-17a表达升高(P=0.047),IL-6表达升高(P=0.043),抑炎性细胞因子IL-10表达减少(P=0.034)。综上所述,TIGIT参与了肿瘤浸润性淋巴细胞免疫功能的调节,介导了肿瘤细胞的免疫逃逸机制,血浆中炎性细胞因子参与了原发性肝癌的发生、发展。(2)TIGIT相关miRNAs(miR-206)在HCC患者外周血单个核细胞中表达水平显著低于正常对照组,且与TIGIT+Treg细胞的频数呈负相关;成功构建了靶向miR-206的TIGIT重组质粒,通过双荧光素酶报告系统验证了miR-206与TIGIT存在靶向关系;成功构建TIGIT过表达Jurkat T细胞稳定株,验证了mir-206可以负向调控TIGIT的表达。