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研究目的:流行病学研究显示,随着肥胖和代谢综合征等疾病的流行,全球非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的发病率也呈现逐年增长趋势,对我国及全球造成了很大的负担。本研究采用油酸诱导建立非酒精性脂肪性肝病细胞模型,并探讨油酸诱导的NAFLD模型中的lncRNA和mRNA差异表达情况,然后筛选出特定的lncRNA,进一步探索其在NAFLD中的作用和机制,为lncRNA在NAFLD中的临床价值研究提供理论支持。研究方法:1.非酒精性脂肪性肝病细胞模型的建立:不同浓度的油酸(10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60 μg/mL)和 DMSO(正常对照组)处理人正常肝细胞系LO2 48h。油红O染色后倒置相差显微镜下进行形态学观察和异丙醇脱色后进行细胞内脂滴半定量分析,判断NAFLD细胞模型是否建立成功。2.应用真核生物环状测序(RNA&lncRNA&circRNA-seq)技术检测油酸诱导脂肪变细胞模型中mRNA和lncRNA的差异表达谱。3.按照差异倍数、lncRNA差异种类等标准,我们筛选出感兴趣的6种lncRNAs进行荧光定量PCR验证。他们分别是lncRNA ENST00000414790、lncRNA ENST00000431095、lncRNA ENST00000608018、lncRNA ENST00000442037、lncRNA ENST00000611525 和 lncRNA ENST00000255183。4.对荧光定量PCR验证结果与测序一致的3种lncRNAs(含lncRNA ENST00000255183、ENST00000442037、ENST00000611525),采用功能获得策略,以pcDNA3.1为载体,分别构建3种目标lncRNAs过表达质粒,转染人正常肝细胞系LO2,之后借助荧光显微镜和荧光定量PCR鉴定目标lncRNAs过表达是否成功。然后进行油酸诱导,以DMSO诱导组作为对照,结合油红O染色及半定量分析的方法,探讨目标lncRNAs功能获得后是否影响LO2细胞脂肪变过程。5.对影响LO2细胞脂肪变过程的lncRNA(lncRNAENST00000255183)进行内源竞争性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)生物信息学预测分析。进一步将预测的mRNA和测序得到的mRNA差异表达谱取交集,筛选出lncRNA ENST00000255183下游调控的mRNA,并采用qRT-PCR进行验证。研究结果:1.倒置显微镜下细胞形态学观察显示,各浓度OA组细胞内均可见大小不同的脂滴,油红O染色后,脂滴为红色,由细胞周围向内呈环状分布。与对照组相比,实验组 OA 浓度为 10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL 和 50 μg/mL时细胞活力无显著统计学意义(P>0.05),OA浓度为60 μg/mL时,LO2细胞活力明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。异丙醇脱色半定量分析结果表明,随着OA浓度增加,LO2细胞内脂滴蓄积程度也逐渐增加,但50 μg/mL以后吸光度相比没有明显差异。2.真核生物环状测序结果显示,与对照组相比,OA组差异表达大于1倍的lncRNAs共有648个,其中表达上调的有351个,表达下调的有297个;差异表达大于1倍的mRNAs有3859个,其中表达上调的有1884个,表达下调的有1975个。3.荧光定量PCR验证结果表明,实验组lncRNA ENST00000414790、lncRNA ENST00000431095 和 lncRNA ENST00000608018 差异变化不显著(P>0.05),变化倍数分别为(0.93±0.07)、(0.65±0.27)、(0.89±0.20)。lncRNAENST00000255183、lncRNA ENST00000442037 和 lncRNA ENST00000611525 均表达下调,下调倍数分别为(0.35±0.07)、(0.52±0.13)、(0.38±0.15),差异具有统计学意义(P<0.05),与测序结果变化一致。4.过表达目标lncRNAs对NAFLD细胞模型的影响:qRT-PCR结果发现,与空载质粒 pcDNA3.1 相比,lncRNA ENST00000255183+、ENST00000442037+、ENST00000611525+组细胞相应lncRNAs表达水平倍数分别增高了(4151.36±1316.90)、(8946.66±2405.24)、(1605.99±329.68),差异具有显著统计学意义(P<0.01)。后续进行油酸诱导,结合油红O染色及半定量分析实验,发现与对照空载质粒组相比,过表达lncRNA ENST00000442037、ENST00000611525没有显著影响脂滴的形成(P>0.05),而lncRNA ENST00000255183过表达组LO2细胞内脂滴形成显著减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.针对可以调控LO2细胞脂肪变过程的lncRNAENST00000255183,进行内源竞争性 RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)生物信息学分析。发现 241个 mRNAs 与 lncRNA ENST00000255183 形成 ceRNA 网络。进一步的 GO 和KEGG pathway分析发现脂肪细胞因子信号通路被显著富集,其中RXRB富集到该通路中。结合mRNA差异表达谱,进行取交集,得到5个mRNAs,他们分别是 RXRB(Retinoic acid receptor RXR-beta)、RNPEPLl(arginyl aminopeptidase-like 1)、CD82、MADD(MAP kinase-activating death domain protein)和KLC2(Kinesin light chain 2)。6.围绕 RXRB、RNPEPL1、CD82、MADD 和 KLC2 这 5 个 mRNAs,进行 qRT-PCR验证。结果发现与对照组相比,OA组RXRB、RNPEPL1、CD82分别下调(2.24±0.35)、(2.55±1.03)、(3.91±0.92)倍,MADD、KLC2 分别上调(3.75±1.36)、(1.20±0.19)倍,均与测序结果一致。研究结论:1.50 μg/mL油酸成功诱导NAFLD细胞模型,可用于后续实验;2.油酸诱导的NAFLD细胞模型存在广泛的lncRNAs差异表达谱;3.LncRNA ENST00000255183参与调控NAFLD的脂滴形成过程,其机制可能是作为ceRNA调控RXRB、RNPEPL1、CD82表达,进而影响脂肪细胞因子信号通路。