LncRNA H19对骨骼肌肌纤维类型组成的调控作用

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:fishonscreen
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骨骼肌是机体的重要组成部分,也是最主要的动物产品。同时骨骼肌还是人体最大的代谢和内分泌器官,对机体代谢调控至关重要。骨骼肌中包含了不同类型的肌纤维,不同肌纤维的组成比例和分布状态很大程度上决定了肉产品的质量。肌纤维类型转化受到复杂的分子网络调控,其中长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)发挥了重要的作用。LncRNA H19在肌肉组织中高表达,在肌肉的生长发育过程中具有重要的作用。单细胞测序结果显示H19在慢肌纤维中的表达极显著高于快肌纤维。因此,本研究以C2C12成肌细胞、小鼠和猪肌卫星细胞为研究材料,探究LncH19对肌纤维类型转化的调控作用。本文首先通过在C2C12细胞系中干扰和过表达H19,检测肌纤维类型的变化;随后构建干扰H19的腺相关病毒载体,注射于2月龄小鼠胫骨前肌,检测小鼠体况、运动能力、肌纤维类型转化、线粒体数目及形态、代谢相关酶活性、抗氧化能力的变化;最后探究H19对猪肌纤维类型转化的调控作用。获得主要结果如下:1.H19促进C2C12细胞中慢肌纤维的生成,抑制快肌纤维的生成,影响细胞代谢水平。H19在小鼠比目鱼肌(慢肌)中的表达量显著高于趾长伸肌(快肌)(P<0.05)。在C2C12细胞系中用si RNA抑制H19的表达,相对于对照组,细胞慢肌相关基因MyHCI和MyHCIIA的蛋白表达水平显著降低(P<0.05);COX5A、COX2、UQCRFS1、FABP3、CD36基因的表达量显著低于对照组(P<0.05)。此外,利用pcDNA3.1质粒构建H19过表达载体,转染C2C12细胞系,相对于对照组,慢肌相关基因MyHCI的蛋白表达水平显著上升(P<0.05),而快肌相关基因MyHCIIB的蛋白表达水平显著下调(P<0.05);过表达H19后,CD36基因的表达量显著高于对照组(P<0.05)。2.小鼠肌肉敲低H19不影响小鼠正常的生理状况,但改变了小鼠胫骨前肌肌纤维亚型组成比例。构建敲低H19的肌肉特异性腺相关病毒载体,肌肉注射2月龄小鼠。实验组和对照组小鼠体重及肌肉、脂肪、肝脏和心脏占体重的比例均无明显差异(P>0.05);葡萄糖耐量实验(glucose tolerance test,GTT)显示实验组和对照组小鼠的血糖值无明显差异(P>0.05);血清常规指标在不同组的小鼠中也没有明显的差异(P>0.05);负重游泳实验与四肢悬挂实验结果均显示实验组小鼠耐力运动的时长相较于对照组显著降低(P<0.05),且不是肌萎缩引发的;在小鼠胫骨前肌中检测不同肌纤维类型相关基因和蛋白表达水平,结果显示实验组慢肌相关基因的m RNA和蛋白表达水平显著下降(P<0.05),快肌相关基因的m RNA和蛋白表达水平显著上升(P<0.05);HE染色结果显示对照组中肌纤维面积显著小于实验组中肌纤维面积(P<0.05)。3.敲低H19影响了胫骨前肌中线粒体的数目和形态。敲低H19后,3月龄小鼠胫骨前肌中线粒体与氧化代谢和脂代谢相关基因的表达量均显著低于对照组(P<0.05),4月龄小鼠相关基因表达量有所恢复;透射电镜发现胫骨前肌中线粒体数目降低,线粒体出现空泡,线粒体内膜嵴结构改变;酶活性检测结果显示,苹果酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶活性差异不显著(P>0.05),但敲低H19后乳酸脱氢酶、超氧化物歧化酶的活性显著低于对照组(P<0.05),乳酸、甘油三酯、丙二醛的含量均显著高于对照组(P<0.05)。4.干扰H19抑制猪肌卫星细胞慢肌纤维的生成。RT-PCR显示猪H19在慢肌中表达水平显著高于其他组织器官(P<0.05);在猪肌卫星细胞成肌分化过程中,H19表达量逐渐升高并且维持在较高水平;核质分离RNA和FISH实验结果显示H19主要存在于猪骨骼肌细胞细胞质中,细胞核中仅有少量存在;在猪肌卫星细胞中用si RNA抑制猪H19的表达,慢肌相关蛋白的表达水平显著下降(P<0.05),快肌相关蛋白的表达水平显著上升(P<0.05)。综上所述,H19在小鼠体内和体外均可调控肌纤维类型的转化,影响线粒体数目、形态和代谢过程;同时发现猪H19在慢肌中高表达,主要存在于猪骨骼肌的细胞质中,且参与肌纤维类型转化的调控。研究结果为调控肌纤维类型转化相关的LncRNA探索提供了研究基础,也为改良猪肉品质提供理论支持。
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