磷(P)是浮游植物生长发育必须的营养元素之一，当环境中的无机磷浓度不足时（磷限制），浮游植物就会通过表达碱性磷酸酶(AP)，以分解环境中的有机磷来维持自己的生长所需。甲藻是海洋生态系统中重要的浮游植物类群，同时也是形成有害藻藻华的主要类群，开展对AP的研究可以帮助我们更清楚地了解在自然海区和形成水华过程中，甲藻利用磷的分子机制及对其自身生长的影响。碱性磷酸酶基因表达的分子机制研究在甲藻中的研究目前刚刚起步，目前该基因的报道仅限于甲藻中个别代表种，如强壮前沟藻(Amphidiniumcarterae Hulbert)，已知该基因的表达水平受环境中无机磷浓度的调控。在海洋浮游植物中存在多种不同类型的AP，其所需的金属离子活性中心也各有不同。本研究以A.carterae为主要研究对象，开展以下实验研究，包括:(1)设计特异抗体，检测在不同磷营养条件下，碱性磷酸酶蛋白在细胞中的表达水平;(2)选取代表常见甲藻类群的米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)，微小原甲藻(Prorocentrum minimum)，链状亚历山大藻(Alexanderium catenella CladeⅡC)，虫黄藻(Symbiodinium kawagutii Clade F，Symbiodinium sp.Clade E)和A.carterae为研究对象，鉴定甲藻中碱性磷酸酶所需的金属离子。　　主要结果如下:　　1.构建A.carterae碱性磷酸酶蛋白的原核表达体系。根据已报道的A.carterae中AP基因的全长编码序列(Acaap)，构建了pEASY-E2/AcaAP基因表达载体。将表达载体质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli)，IPTG诱导表达，产物经Ni-NTA纯化后，主要以可溶形式存在，分子量大约为70 kDa。　　2.根据已报道的A.carterae中AP基因的全长编码序列(Acaap)翻译的氨基酸序列分析，选择蛋白N-端附近亲水区长度为180个氨基酸(220-400)的肽段AcaAP-180进行原核表达，构建了pEASY-E2/AcaAP-180基因表达载体。原核表达产物经纯化后用于制备特异性多克隆抗体。　　3.实验发现当A.carterae培养基中的无机磷耗尽后，磷限制组在培养开始后没有明显的指数增长期，而是很快进入平台期，细胞浓度仅为对照组的一半，碱性磷酸酶活性(APA)呈现出显著的上调趋势(p＜0.01;two-tailed T-test)。　　4.Western blot实验表明，磷限制组中碱性磷酸酶蛋白(AcaAP)的表达量呈显著增高趋势，而对照组的AcaAP的表达量一直处于较低的水平。通过甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)内参校正后，半定量的分析结果显示，磷限制组和对照组的之间的AcaAP的表达量差异显著，前者的表达量是后者的50-fold。另外，AcaAP的蛋白表达量和APA活性存在良好的正相关关系(p＜0.05，R2＞0.8)。　　5.利用在线软件预测AcaAP高级结构，AcaAP的二级结构主要由α螺旋和β折叠组成，且以β折叠为主，发现AcaAP的三级结构是由两个相似的部分组成，中间的空隙部分预测是结合金属离子的部分。结果显示的模型为2cn3A02，该模型来自梭菌的水解酶，活性中心是Ca2+。　　6.通过检测不同金属离子添加后的甲藻AP活性，结果显示甲藻AP依赖于Ca2+或Mg2+作为其金属活性中心，而典型AP-phoA活性中心所需的Zn2+对甲藻中AP的酶活性不但无明显促进作用，反而产生一定程度的抑制作用。例如A.carterae，A.catenella经检测，原核表达的AcaAP具备一定碱性磷酸酶活性，活性所需的金属离子同样为Ca2+或Mg2+。A.carterae的细胞全蛋白的SDS-PAGE胶酶活性分析显示其活性蛋白的活性中心是Ca2+，分子量约为130 kDa。　　7.本实验中检测的甲藻(A.carterae，P.minimum)的碱性磷酸酶活性最适pH范围为pH7-10，当pH＜7或＞10时，酶活性受到显著抑制，而A.catenella和K.mikimotoi中的AP活性保持稳定，并不会随着pH升高而呈现出显著变化。　　综上所述，甲藻中的AP为一类新型的碱性磷酸酶，其活性中心所需的金属离子为Ca2+或Mg2+，并且其活性蛋白可能以二聚体形式存在。