背景乳腺癌作为女性常见的恶性肿瘤之一,近年来在全球范围内发病率逐年升高。目前生物标记物的使用已经成为协助乳腺癌诊断和治疗的一种手段,其中血清学生物标记物与其他类型的生物标记物相比,检测更方便。人乳腺珠蛋白(hMAM)是子宫珠蛋白基因家族中的一个乳腺特异性成员,在乳腺上皮细胞中低表达,在乳腺癌中高表达,已被证明与肿瘤早期发现和转移有关。且有研究表明,血液中的hMAM可作为乳腺癌独立预后的标志物,已成为检测乳腺癌微转移的特异性指标之一。因此,通过检测外周血中hMAM的含量可为乳腺癌患者提供筛查手段,但目前常用的检测hMAM的方法均有一定的局限性,急需建立一种hMAM快速定量的检测方法。目的本研究以双抗体夹心法为原理,建立hMAM时间分辨荧光免疫层析定量检测方法,为乳腺癌诊断和治疗监测提供一种快捷、准确且经济的技术。方法1.hMAM重组蛋白表达纯化及鉴定:将BL21-pET32a-hMAM重组菌诱导表达,经超声破菌、溶液洗涤、尿素变性溶解、DEAE阴离子交换层析、Ni2+亲和层析、透析复性等系列过程获取重组蛋白,再经SDS-PAGE电泳鉴定。2.hMAM抗体的制备:经鉴定后的目的蛋白多次免疫兔子,得到一定效价的抗血清,经抗原亲和纯化后,HPLC检测其纯度,并将其作为包被抗体与hMAM单克隆抗体进行配对。3.初步建立荧光层析检测方法:通过对原材料筛选、hMAM标记抗体量、hMAM包被抗体量、微球活化用EDC和NHS量、微球保护液组方等研究确定荧光免疫层析制备的最优工艺,初步建立hMAM荧光层析检测方法。4.荧光免疫层析试纸条性能评价:对本研究制备的荧光层析试纸条进行线性范围、精密性、特异性、准确度、稳定性等性能评价,并与CUSABIO公司的Human Mammaglobin ELISA试剂盒进行方法学比对。结果1.在37℃条件下0.5 mmol/L IPTG诱导5 h,重组菌获得了高效表达。建立了重组蛋白纯化工艺,得到纯度较高的重组蛋白。2.获得较高效价的抗血清,经抗原亲和纯化后,洗脱液峰值区抗体纯度较高,且作为包被抗体与hMAM单克隆标记抗体可较好配对。3.初步建立了 hMAM荧光层析检测方法。筛选出了最适的荧光层析用原材料,最优的微球保护液组方;确定了活化50 μL微球时,10mg/mLEDC最适量为20 μL,20 mg/mLNHS最适量为200 μL,最适的抗体标记量为20 μg,最适的T线包被浓度为1.0 mg/mL,C线包被浓度为2.0 mg/mL。4.荧光免疫层析试纸条性能评价:在上述最优工艺基础上制备试纸条,试纸条线性范围为0.313-20ng/mL,相关性好;批内的变异系数均小于10%,批间的变异系数小于15%,符合精密性要求;检测高、中、低值样本,回收率均在85%-115%内,准确度符合要求;与CEA、CA153无明显交叉反应,特异性较好;与ELISA试剂盒平行检测46例临床标本相关性较好。结论1.本研究中重组蛋白纯化采用两步纯化法,目的蛋白纯度高;并采用抗原亲和层析纯化多抗,抗体纯度达到要求。2.优化了微球保护液组方,使得微球偶联过程中均一性较好;采用hMAM单克隆抗体作为标记抗体,hMAM多抗作为包被抗体,两者配对性较好,解决了抗体配对不佳且成本贵的问题。3.建立了定量检测hMAM的时间分辨荧光免疫层析方法,为乳腺癌筛查、治疗及预后提供了一种方便快捷、精密性好、准确度高的辅助检测手段。