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以NaNO2为筛选培养基的唯一氮源,从土壤中筛选出20株产亚硝酸还原酶的真菌(N1~N20),其中N4菌株的酶活力最高,达9.32U/mL。通过对该菌株ITS序列的测定及菌落形态的研究,发现其属于被孢霉菌(Mortierellasp.)。
N4菌株的最佳产酶培养基配方为:3%葡萄糖,0.2%蛋白胨,0.1%NH4Cl,0.15%K2HPO4,0.05%KCl,0.075%MgSO4,0.2%NaNO2,0.003%FeSO4,pH8.0;最佳培养条件为:3%接种量,40%摇瓶装液量,180r/min摇床转速,30℃,培养48h。在此优化条件下,该菌的发酵液中亚硝酸还原酶活力为56.65U/mL,是优化前的6.1倍。
对N4菌株所产的亚硝酸还原酶酶学性质进行研究,结果表明,该酶的最适pH为7.4,最适温度为35℃,在50℃以下,pH7.0~7.8时稳定。EDTA、Fe2+、Ni2+和Co2+对该酶有较强的抑制作用,Ba2+则对该酶有较强的激活作用,提高了48.57%。
对该酶降解烟叶中亚硝酸盐的条件进行初步研究,最佳反应条件为:pH7.4,35℃。在此优化条件下,烟叶提取液和烟丝中亚硝酸盐的降解率都在95%以上。延长反应时间或增加酶量,亚硝酸盐的降解率可达到100%。