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沙门氏菌是最常见的食源性致病之一,由该菌引起的食物中毒病例在世界范围内居于首位。该菌有2600多个血清型,分布具有地域性的特点。针对沙门氏菌血清型的检测是非常必要的,传统检测方法是利用国标的方法。该检测方法程序复杂、耗时长而且检测成本较高,不能满足食品生产企业和质量监督检验部门快速检测的要求。因此,建立一种直接针对血清型的分子快速检测方法就显得非常重要。本研究是通过生物信息学技术和比较基因组的方法,分别筛选到了肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌和海德尔堡沙门氏菌的特异性基因,并以此分别建立了多重PCR检测体系、real-time PCR检测体系和real-time NASBA检测。主要研究结果分述如下:1,6种沙门氏菌常见血清型分子检测靶点的发掘首先选取沙门氏菌6个常见血清型的代表菌株并通过GenBank数据库获得该菌株的全基因组序列的信息,分别是鼠伤寒沙门氏菌LT2（NC003197.1）、肠炎沙门氏菌P125109（NC011294.1）、乙型副伤寒沙门氏菌SPB7（NC011205.1）、丙型副伤寒沙门氏菌RKS4594（NC012125.1）、都柏林沙门氏菌CT02021853（NC011205.1）和海德尔堡沙门氏菌SL476（NC011083.1）。再将以上各个菌株的每个基因进行BLASTN程序的比对,选择与本血清型同源性较高,同时与其它血清型同源性较低的基因作为血清型准特异性基因。各个血清型分别获得8、12、18、7、15和10个的准特异性基因。并以此为模板设计引物,利用实验室保存的48株沙门氏菌和18株非沙门氏菌进行PCR验证,结果表明:鼠伤寒沙门氏菌获得2个血清型特异性基因hsdS和STM4494,肠炎沙门氏菌获得3个血清型特异性基因kil、SEN1382和SEN1383,乙型副伤寒沙门氏菌获得3个血清型特异性基因SPAB01122、SPAB01123和SPAB01124,丙型副伤寒沙门氏菌获得3个血清型特异性基因SPC0871、SPC0872和SPC0908,都柏林沙门氏菌获得2个血清型特异性基因SeDA1118和SeDA2283,海德尔堡沙门氏菌获得4个血清型特异性基因SeHAC2639、SeHAC2640、SeHAC3258和SeHA32590。同时又对每个血清型特异性引物的灵敏度进行了评价,各个引物的灵敏度均在98.33ng/μl-140fg/μl之间。血清型特异性基因功能分析,75%的特异性基因是编码的蛋白参与细胞的物质代谢过程,只有个别基因是编码膜蛋白、血清型抗原合成蛋白和与噬菌体相关的蛋白。2,单一沙门氏菌血清型的多重PCR检测方法的建立以SPAB01124和invA基因作为靶点,建立乙型副伤寒沙门氏菌和沙门氏菌属检测的双重PCR检测方法。当反应体系分别获得为284bp和384bp时,该检测结果为阳性。使用48株沙门氏菌和18株非沙门氏菌对该检测方法进行了特异性测试,结果表明只有乙型副伤寒沙门氏菌获得两条扩增片段,而其他菌株只获得一条或没有扩增片段均为阴性,特异性达到100%。该体系的DNA灵敏度能达到1.91ng/ul;在经过10h增菌培养后,纯菌的菌落灵敏度为2.2 cfu/ml,人工污染牛奶样品的检测限小于10cfu/10ml。而且该检测方法对大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌具有一定的抵抗能力。以SeDA1118、SeDA2283和invA基因作为靶点,建立都柏林沙门氏菌和沙门氏菌属检测的多重PCR检测方法。当反应体系分别获得284bp、378bp和463bp时,该检测结果为阳性。利用48株沙门氏菌和18株非沙门氏菌进行特异性验证,结果表明只有都柏林沙门氏菌同时获得三条扩增片段,特异性达到100%。当模板浓度小于1.87pg/μl时,该体系不能同时获得3条扩增片段,该体系DNA灵敏度为1.87pg/μl。通过10h的增菌培养,该方法的菌落灵敏度为10cfu/ml。用N×103cfu/ml-N×10-1 cfu/ml的大肠杆菌或肠炎沙门氏菌与102cfu/ml的都柏林沙门氏菌共同培养,进行PCR反应,结果表明在以上浓度的干扰菌不能影响到最终的检测结果。人工污染牛奶样品,经过LB液体培养基37℃增菌8h,检测限可以小于10 cfu/10ml。以SeHAC2640、SeHAC3259/和invA基因作为靶点,建立海德尔堡沙门氏菌和沙门氏菌属检测的多重PCR检测方法。当反应体系分别获得2121bp、284bp和589bp时,该检测结果为阳性。利用48株沙门氏菌和18株非沙门氏菌进行特异性验证,结果表明特异性达到100%。该反应体系的DNA灵敏度评价结果表明,当模板浓度为1.4ng/μl时,能同时获得3条扩增片段;当模板浓度降到1.4fg/μl,只能同时获得139-141和pHAm9引物的扩增片段。经过10h增菌培养后,即使初始的菌体浓度为3.8×10-1 cfu/ml时,该方法可以获得3条扩增片段。当大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的干扰浓度达到104cfu/ml,也不会影响对目标血清型的检测,说明该检测方法具有一定的抗干扰能力。人工污染牛奶样品经过LB液体培养基37℃增菌10h,3对引物均能获得扩增产物的检测限达到3.8 cfu/10ml。3,三种沙门氏菌血清型多重PCR检测方法以SEN1383、STM4494、SPC0872和invA基因作为靶点,建立肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌和沙门氏菌属检测的多重PCR检测方法。当反应体系分别获得141bp、534bp、212bp和284bp时,该检测结果为阳性。利用48株沙门氏菌和18株非沙门氏菌进行特异性验证,结果表明,特异性达到100%。通过10h的增菌培养,该方法对以上三种血清型菌落灵敏度均小于10cfu/ml。选取都柏林沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌作为该检测的干扰菌,用N×104cfu/ml-Ncfu/ml的干扰菌分别与102cfu/ml的沙门氏菌的目标血清型共同培养,进行PCR反应,结果表明在该检测体系中能抵抗以上3种血清型对目标菌株检测的干扰作用。人工污染实验表明,为了实现3个血清型的检测限均小于10cfu/10ml,需经过LB液体培养基37℃增菌12h。4,海德尔堡沙门氏菌的real-time PCR检测方法以SeHAC3258和invA基因为模板分别设计引物和探针（荧光信号分别为JOE和FAM）,建立海德尔堡沙门氏菌和沙门氏菌属检测的real-time PCR检测方法。当同时检测到两个信号的扩增曲线时,该检测结果为海德尔堡沙门氏菌阳性结果。通过48株沙门氏菌和18株非沙门氏菌进行特异性验证,结果表明,特异性达到100%。该real-time PCR对基因组的灵敏度为112.4fg/ul;对纯菌增菌培养前和增菌培养后的灵敏度分别为2.4×104cfu/ml和2.4cfu/ml。该检测方法在不同浓度模板情况下,变异系数在0.43-1.15%之间,表明该体系具有较好的重复性。在鸡肉和猪肉背景菌群干扰作用下,该检测方法的检测限分别为2.54×103cfu/ml和1.7×102cfu/ml,说明该检测方法具有较好的抗干扰能力。而且,利用试剂盒法提取样品中的DNA过程中可以去除样品中Taq酶反应抑制剂,避免检测出现假阴性结果。在人工污染鸡肉和猪肉样品中,经过LB液体培养基37℃增菌6h,该体系的检测限能达到1 cfu/25g。5,沙门氏菌及其丙型副伤寒沙门氏菌real-time NASBA检测方法以xcd基因的保守序列作为检测靶点,建立沙门氏菌检测的real-time NASBA方法。通过48株沙门氏菌和18株非沙门氏菌进行特异性验证,结果表明,所有沙门氏菌能获得扩增曲线,非沙门氏菌无荧光信号被采集,特异性达到100%。当样品中RNA模板的浓度高于10.5fg/ul时,该real-time NASBA可获得有效的扩增曲线;通过10h增菌培养,该方法的菌落灵敏度为7×10-1cfu/ml。该检测方法针对不同血清型的模板及其在不同模板浓度情况下,标准偏差在0.613-2.203之间,表明该体系对沙门氏菌的检测具有较好的重复性。提取样品的总RNA经过DNaseⅠ酶处理,仍能获得扩增曲线;但是经过RNase H酶处理,无任何扩增,证明该反应是直接针对于RNA的扩增技术。而且,该方法在对热处理24h后死菌的检测与国标检测的结果一致,均呈现阴性。该体系在4.75×107cfu/ml的猪肉背景菌群的干扰下,鼠伤寒沙门氏菌的检测限能达到9.5×103cfu/ml,说明该方法具有较好的抗干扰能力。人工污染实验表明,经过LB培养基37℃增菌10h,在猪肉、牛肉和牛奶中的检测限均小于10cfu/25g（ml）。以SPC0908和xcd基因作为模板设计引物和分子信标（JOE和FAM）,建立丙型副伤寒沙门氏菌和沙门氏菌检测的real-time NASBA方法。通过48株沙门氏菌和18株非沙门氏菌进行特异性验证,结果表明,特异性达到100%。当样品中RNA模板的浓度高于40.94fg/ul时,该方法可获得两条扩增曲线;通过10h增菌培养,该方法的纯菌菌落灵敏度和人工污染鸡肉和猪肉的灵敏度均小于10cfu/ml。针对不同浓度的目标RNA的检测,标准偏差均在1.229-5.28之间,表明该方法具有较好的重复性。样品中存在108cfu/ml和107cfu/ml的猪肉和鸡肉自然菌群的条件下,该方法的检测限能达到103cfu/ml,表明该方法具有较好的抗干扰能力。