胸腺素04 (thymosinbeta4, Tβ4)是一种多肽,它由43个氨基酸组成,相对分子质量为4963Da,在哺乳动物中高度保守。胸腺素β4是从牛胸腺素5中分离所得,广泛分布于机体的各个部分,调节细胞多种生命活动。在细胞内胸腺素β4并不是直接单独发挥其生物学作用的,它通常是间接的与其他相关蛋白结合成复合体,行使多种生物学功能,包括通过引导内皮细胞迁移与分化而导致血管的形成、促进伤口愈合、抗炎症等功能。本实验室之前获得了一批转Tβ4基因的阿尔巴斯白绒山羊,经过与普通白绒山羊产绒量的对比发现,其中一些转Tβ4基因的绒山羊产绒量有明显提高,但T β4基因是如何影响产绒量的原因和机制还不清楚,还需要进一步的研究。本研究基于以上实验目的,利用实验室已经获得的转Tβ4基因的阿尔巴斯白绒山羊相关组织和细胞为实验材料,初步探索了其在MAPK-ERK/p38和PI3K-Akt信号通路中的作用,并筛选和鉴定与Tβ4相互作用的蛋白,为与毛囊生长有关信号通路的作用机制提供理论依据和相关实验支持。1、运用Western Blot技术对转Tβ4基因绒山羊皮肤样品中的相关蛋白表达量进行检测。分别取转基因后产绒量明显提高和未见明显提高的绒山羊皮肤组织为实验组,并以同一细胞系来源的普通体细胞克隆绒山羊皮肤组织作为对照组,检测了AKT、ERK、p38三个基因表达水平和磷酸化水平的变化。结果显示,与体细胞克隆绒山羊相比,产绒量明显提高的绒山羊皮样中ERK和AKT的蛋白表达水平和磷酸化水平都有所上调,而产绒量未见明显提高的绒山羊皮样中蛋白表达水平和磷酸化水平变化不是十分明显。2、运用免疫共沉淀联合质谱技术筛选与胸腺素β4相互作用的蛋白。选取转T β4基因的绒山羊皮样为材料,并以同一细胞系来源的普通体细胞克隆绒山羊皮样为对照组,分离得到成纤维细胞。将经过免疫共沉淀法富集下来的蛋白通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,考马斯亮蓝染色,找到凝胶中与对照组存在差异的条带并切取下来,利用蛋白质质谱分析技术鉴定这些差异条带的组成成分。质谱分析结果显示：β肌动蛋白(β-actin,ACTB)、调宁蛋白1 (calponinl, CNN1)和血管抑制因子1 (vasohibinl, VASH1)这三种蛋白可能与T β4有相互作用,并进行下一步的实验验证。3、运用哺乳动物双杂交系统分别对Tβ4和β肌动蛋白、调宁蛋白1、血管抑制因子1三种蛋白的互作进行鉴定。将Tβ4片段进行酶切并连接到杂交系统的pACT载体上,同时将β肌动蛋白、调宁蛋白1、和血管抑制因子1的cDNA片段进行酶切,分别连接到杂交系统的pBIND载体上,这两个载体与系统中的pG51uc载体一同转染到Hela细胞中,经过24-48h培养后,通过检测荧光素酶的活性,得出这三种蛋白均与Tβ4有相互作用关系,其中T β4与血管抑制因子1作用关系较明显。所以通过上述实验研究,初步确定了两条可能参与T β4介导的毛囊生长信号通路和与Tβ 4有相互作用的蛋白。这些信号通路和蛋白之间的相互作用可能会引起绒山羊毛囊生长发育等相关表型的改变,这对于今后提高阿尔巴斯白绒山羊产绒量具有重要的意义,为生产实践提供理论依据。