论文部分内容阅读
香蕉枯萎病由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)侵染而引起,能破坏寄主的维管束系统,引起植株死亡,导致严重的产量损失。香蕉枯萎病菌1号生理小种(Foc1)主要危害粉蕉(Musa AAB),现在属于世界性分布,4号生理小种(Foc4)几乎能危害所有香蕉种类,危害性最大。目前缺乏对香蕉枯萎病菌有效的防治措施,从分子水平上研究致病相关基因揭示其致病机理显得尤为重要。本研究室完成了在3种不同的碳源下(寄主蕉类细胞壁,葡萄糖,果胶)香蕉枯萎病菌Foc1和Foc4转录组的差异性的分析。在此基础上从Foc转录组(Foc4_CCW vs Foc1_MCW)结果中,将转录组结果与PHI(The Pathogen-Host Interaction Database)数据库BLAST比对,挑选细胞壁诱导下Foc4较Foc1相对表达量较高的基因,并预测致病相关基因,挑选出4个基因,comp18499_c0,comp14433_c0,comp 16617_c0,comp 17473_c0。其中comp18499_c0是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶相关基因,comp14433_c0是程序性死亡蛋白相关基因,comp 17473_c0是蛋白激酶相关基因,comp 16617_c0是F-Box蛋白基因。设计引物用实时荧光定量来验证这4个基因在香蕉枯萎病菌侵染香蕉过程中的表达量情况,选取三个时间点,分别是0 h,48 h,96 h。结果发现,comp 16617_c0基因在Foc1中几乎不表达,而在Foc4中表达量高,与0h相比,48 h和96 h表达量显著上调,特别在48 h,表达量达到最高,是0 h的200倍。comp 17473_c0基因在Foc1中虽有表达,但是表达量明显低于在Foc4中的表达量,在Foc4中与0 h相比,comp17473_c0表达量一直处于较高水平。因此推测comp 16617_c0和comp 17473_c0基因跟香蕉枯萎病菌Foc4致病性相关。分别以Foc4总DNA和cDNA为模版进行克隆,获得comp 16617_c0和comp17473_c0的基因的DNA和cDNA片段,并将其送到生物公司测序,然后根据目的基因的序列进行生物信息分析。comp 16617_c0的Foc1和Foc4的DNA扩增产物约为1080 bp,cDNA扩增产物1080bp,DNA编码358个氨基酸。2个小种的核苷酸分析,结果显示Foc1-comp 16617_c0和Foc4-comp 16617_c0无内含子,两个小种核苷酸的同源性为99.0%。编码的氨基酸同源性为99.2%。两个小种在氨基酸水平上存在着3个位点差异,分别是在96,202,322位点上。编码的核苷酸存在11个位点的差异。将comp 16617_c0的氨基酸序列放在NCBI上进行BLAST比对,结果表明该基因没有检测到假定保守区域。comp17473_c0的Foc1和Foc4的DNA扩增产物约为1444 bp,CDNA扩增产物都为1332bp,2个小种的comp17473_c0核苷酸分析,结果显示Foc1-comp 17473_c0和Foc4-comp17473_c0有一个内含子,Foc1-comp17473_c0DNA编码460个氨基酸,Foc4-comp17473_c0DNA编码462个氨基酸。comp17473_c0两个小种核苷酸的同源性为99.2%。编码的氨基酸同源性为97.8%。comp17473_c0两个小种在氨基酸水平上存在着10个位点差异,编码的核苷酸存在12个位点的差异。将香蕉枯萎病菌comp17473_c0的氨基酸序列放在NCBI上进行BLASTP比对,结果表明comp17473_c0属于CCL1家族蛋白,100-281aa为其保守区域。在对四个基因进行生物信息分析后,对要敲除的comp17473_c0和comp16617_c0进行命名,comp17473_c0命名为Foccak1,comp16617_c0命名为Focfb1。通过TAIL-PCR获得了Foc4-Focfb1和Foc4-Foccak1基因的侧翼片段,采用ATMT方法获得Foc4-△Focfb1和Foc4-△Foccak1基因敲除突变体,并测定突变体的致病性。结果表明,Foc4-△Focfb1和Foc4-△Foccak1基因的敲除突变体较野生型Foc4生物学性状几乎没有改变。采用盆栽伤根淋灌接种方法,将野生型Foc4和敲除突变体Foc4-△Focfb1和Foc4-△Foccak1接种巴西蕉苗,孢子浓度分别为1.0×10~5个/mL,1.0×10~6个/mL,1.0×10~7个/mL每个处理接种10株,每个处理重复3次,接种40 d后观察发病情况。结果显示,Foc4-△Focfb1接种的巴西蕉病情指数较野生型Foc4的病情指数低10%左右,说明Focfb1基因的敲除对致病力有减弱的影响;Foc4-△Foccak1接种的巴西蕉病情指数较野生型Foc4的病情指数差异不显著,说明△Foccak1基因的敲除对其致病力并没有太大影响。本研究丰富了Foc与寄主互作的分子机制,为香蕉枯萎病菌致病相关基因的筛选及病害防治提供科学的依据。