研究背景与目的:肺癌目前是发病率第二高的恶性肿瘤,并且在男性和女性中其致死率目前都居第二位。截止到2014年,美国肺癌的患病人数已高达430,090人,且以每年224210人的速度在增长。我国近年来随着人口的老龄化和环境污染的加重,肺癌的发病率也开始成倍增加,每年约有40万人被确诊患有肺癌,发病率高达61.4/10万,成为世界上肺癌患者最多的国家。尽管诊断、手术和放化疗技术在过去的十年里都得到了很大的提高,肺癌的转移和死亡率仍居高不下,其5年生存率仅有约15%。肺癌根据细胞来源的不同可分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),其中NSCLC约占全部肺癌的87%。NSCLC又分为腺癌、鳞癌和大细胞肺癌,其中腺癌是最常见的肺癌类型。目前,大部分患者在发现肺癌时已进入肿瘤的中晚期,甚至丧失手术机会,而即使在早期发现肺癌并行手术切除,术后复发和转移率也高达约1/3。肿瘤的转移是肿瘤导致死亡的重要原因。肺癌最常发生的远处转移部位包括神经系统、骨、肝、呼吸系统和肾上腺等,其中骨是肺腺癌最常见的转移部位,39%的肺腺癌患者会发生骨转移。肺癌的骨转移主要表现为融骨性骨质破坏,导致骨折、严重骨痛等,甚至导致瘫痪,严重影响患者生存质量和预后,我们的前期研究也发现NSCLC骨转移患者3年生存率不足30%。肿瘤的骨转移是一个复杂的过程,目前认为肺癌骨转移的发生机制主要有以下几个步骤:肿瘤细胞发生上皮间质转化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)并从原发灶脱落入血、肿瘤细胞随血液移动到骨组织、肿瘤细胞通过与成骨细胞和破骨细胞的相互作用促发融骨性破坏和肿瘤增殖,最终形成骨转移灶。趋化因子配体(chemokine ligands)是一类小于100个氨基酸的小分子化学趋化因子,在肿瘤的生物学特性及肿瘤免疫方面发挥重要作用。根据其开始两个半胱氨酸残基的不同可分为CC、CXC和XC三类。CCL7是CC趋化因子家族的一员,已被发现在乳腺癌、肾癌、胃癌、结直肠癌等多种肿瘤中高表达,并可促进肿瘤的增殖、迁移和侵袭等。同时,CCL7在免疫系统中也发挥重要作用,可调控单核细胞、T细胞、NK细胞、树突状细胞等多种免疫细胞。然而,CCL7在肺癌中的作用和机制仍不清楚。研究方法:首先,我们选取在长征医院进行手术的nsclc患者原发灶样本和瘤旁肺组织样本各93例和nsclc骨转移灶样本49例,通过表达谱芯片检测nsclc原发灶和骨转移灶间的基因表达差异,并通过qrt-pcr和ihc染色检测了ccl7在瘤旁肺组织、nsclc原发灶、nsclc骨转移灶间的表达差异,通过统计ihc染色结果ccl7表达水平与nsclc患者预后的相关性。然后,我们用ccl7刺激nsclc细胞系a549和pc9,并检测了ccl7对nsclc细胞增殖、迁移、侵袭、emt及诱导破骨细胞分化的作用。ccl7的受体主要包括ccr1、ccr2和ccr3,我们进一步通过qrt-pcr和ihc染色检测了ccr1、ccr2和ccr3在nsclc原发灶和骨转移灶间的表达差异,并通过ccr2抑制剂和ccr3抑制剂检测了抑制ccr2和ccr3对ccl7在nsclc细胞中作用的影响,进一步通过慢病毒转染构建了ccr3抑制的a549-shccr3稳转细胞株,并通过裸鼠左心室荷瘤检测了体内抑制ccr3对a549细胞转移灶形成能力的影响。最后,我们通过数字基因表达谱测序检测了ccl7刺激a549细胞后基因表达的变化,通过go分析和kegg分析探索可能的下游通路,并通过qrt-pcr验证了ccl7/ccr3通路对下游基因表达的调控作用。研究结果:我们发现ccl7在nsclc骨转移灶中相对nsclc原发灶显著高表达,并且ccl7高表达的nsclc患者临床预后较nsclc低表达的患者明显更差。通过ccl7因子刺激a549和pc9细胞后,发现ccl7可促进a549和pc9细胞的迁移和侵袭能力,但对细胞增殖无明显作用,且通过westernblot实验发现ccl7可促进a549和pc9细胞的emt。通过ccl7因子刺激小鼠骨髓巨噬细胞(bonemarrowmacrophage,bmm)细胞后,我们发现ccl7不能直接促进破骨细胞分化,但来源于ccl7刺激的a549细胞的条件培养基相对来源于对照组a549细胞的条件培养基能更为明显的促进bmm细胞向破骨细胞的分化。同时,我们发现在ccr1、ccr2和ccr3中,ccr2和ccr3均在nsclc骨转移灶中相对原发灶高表达,并与nsclc患者的总体预后和肿瘤进展相关,且ccl7可促进ccr3的表达。通过抑制剂分别抑制ccr2和ccr3后,我们发现抑制ccr3可抑制ccl7对a549和pc9细胞迁移、侵袭、emt及诱导破骨细胞分化的调控作用,但抑制ccr2对ccl7在a549和pc9细胞中的作用无明显影响。通过慢病毒转移构建a549-shccr3稳转细胞株后,对裸鼠进行左心室荷瘤,通过活体成像检测发现在体内抑制CCR3可显著抑制A549细胞转移灶的形成。最后,我们通过数字基因表达谱测序和信息学分析发现CCL7可促进多个与肿瘤发展密切相关的基因表达,如IL1B、CYP1B1、FLCN等,并可能通过激活Ras通路发挥作用,并且通过qRT-PCR验证了CCL7在A549和PC9细胞中对这些下游基因表达的促进作用,并发现抑制CCR3可部分抑制CCL7对下游基因表达的调控作用。结论:基于以上研究结果,我们认为CCL7可能在NSCLC转移特别是骨转移过程中发挥重要作用,CCL7可通过诱导NSCLC细胞的EMT促进其迁移和侵袭能力,并可促进NSCLC细胞诱导的破骨细胞分化,且在NSCLC细胞中,CCL7主要通过激活CCR3发挥作用,而抑制CCR3可在体内明显抑制NSCLC的转移。且CCL7/CCR3通路可能通过激活Ras信号通路在NSCLC中发挥作用。这些研究结果表明CCL7/CCR3通路在NSCLC的骨转移过程中可能发挥重要作用,并可能作为NSCLC骨转移新的药物治疗靶点。