研究背景：瘢痕是皮肤组织创伤愈合的自然结局,分为炎症反应、组织增生和重塑三个阶段,这一过程的基础是炎性细胞和修复细胞的的一系列活动。在整个创伤修复愈合过程中,创面局部微环境中的多种细胞与细胞外基质、多种蛋白分子之间受到机体精细调节,多种细胞因子可在细胞迁移和增殖、细胞外基质沉积和降解等各个方面影响创面愈合。当这种调节的动态平稳被破坏,则可引起瘢痕组织的过度增生而形成增生性瘢痕。增生性瘢痕是严重创伤及外科手术后常见的并发症,易造成相应部位的功能异常和外形改变,给患者带来一系列功能、外观和心理等方面的严重障碍。虽然随着细胞生物学和分子生物的快速发展,推动了瘢痕研究的深入,但其确切的发病机制仍未完全阐明。增生性瘢痕形成机制和防治的研究已成为当今外科领域急待解决而又非常棘手的难题之一。目前临床上对增生性瘢痕的治疗主要采取手术、机械压力法、药物、放疗、激光等多种方法进行单一或联合治疗,但效果仍不理想。目前认为,增生性瘢痕是以成纤维细胞异常增生和胶原、细胞外基质异常沉积为特点。多种致纤维化细胞因子参与增生性瘢痕的形成,但转化生长因子(TGF-β1)由于其在纤维组织积聚中发挥多种作用,可促进成纤维细胞的增殖、促进细胞外基质的产生和抑制胶原降解,被认为是瘢痕纤维化的最重要的生长因子。在烧伤后的增生性瘢痕成纤维细胞中TGF-β1 mRNA表达较正常皮肤明显增加。随后的研究证实,Smads蛋白可以将TGFP信号直接由细胞膜激酶受体转导入细胞核内,是目前已知唯一的TGF-β受体(TβR)胞内激酶底物,在TGF-β1胞内信号传导起关键作用。Smads被TβR激活后,转移到细胞核内调节基因转录。虽然TGFβ/Smads信号通路较为简单,但Smads蛋白与受体相互作用后形成复合物在细胞核内与特意转录因子相作用调控TGFP多种功能。由此可见,调控TGFβ/Smads信号通路阻断TGF-β1的生物学效应可能是抑制瘢痕增生的一个关键点。粉防己碱(Tetrandrine)是从千金藤属防己科植物汉防己的根中提取的一种生物碱,化学结构属双苄基异喹啉类化合物。通过对其药理作用的深入研究,发现该药可通过抑制肺组织与肝组织内成纤维细胞过度增殖和胶原等细胞外基质的合成、拮抗各种致纤维化因子的释放而发挥其抗矽肺、抗肝纤维化作用,并被随后的一系列临床研究所证实。研究表明,粉防己碱通过上调Smad7阻断TGF-β1表达及信号通路来抑制肝星形细胞。前期研究已证明粉防己碱能有效抑制TGF-β诱导的瘢痕成纤维细胞体外增殖和胶原合成,并在低于有效抑制细胞增殖浓度时仍对TGF-β促瘢痕样组织收缩具有阻断效应,提示粉防己碱有抑制增生性瘢痕形成的可能。但这些研究仍局限于初步的实验观察,目前未见从细胞信号转导角度系统研究粉防己碱抗瘢痕增生的分子药理作用机制的国内外文献报道；对粉防己碱抗瘢痕增生的具体作用靶点及其特点尚缺乏分子水平上的确切了解。因此,本实验拟以TGF-β/Smad信号转导通路为主线,通过应用RNAi干涉技术、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot、流式细胞检测和免疫细胞化学及瘢痕成纤维细胞体外培养等方法,系统观察粉防己碱对增生性瘢痕成纤维细胞TGF-β/Smad信号转导通路的干预作用,并采用基因芯片技术筛选粉防己碱干预前后瘢痕成纤维细胞差异表达基因,探讨粉防己碱干预后基因表达谱与TGF-β/Smad信号转导通路和胶原代谢改变的相关性及与其它信号串话的变化。旨在深入阐明粉防己碱抗瘢痕增生的分子机制,为增生性瘢痕的防治提供新思路,为进一步的临床应用提供理论依据和实验基础。目的：1.探讨并建立一种简便易行、培养周期短的增生性瘢痕成纤维细胞体外培养模型,并进行粉防己碱浓度筛选,为后续实验提供基础。2.探讨粉防己碱作用增生性成纤维细胞后对其TGF-β/Smads信号表达、增殖及胶原合成的影响。3.探讨粉防己碱作用对Smad7沉默增生性瘢痕成纤维细胞TGF-β1及其下游信号Smads表达的影响。4.探讨粉防己碱干预后基因表达谱与TGF-β/Smad信号转导通路和胶原代谢改变的相关性及与其它信号串话的变化。方法：1.组织标本取自烧伤后增生性瘢痕患者,近期无使用瘢痕药物治疗史,不伴有肿瘤或其他严重疾病,采用组织块贴壁结合胰蛋白酶消化法体外分离培养人增生性瘢痕成纤维细胞,进行传代培养并进行冻存。倒置相差显微镜下观察培养的成纤维细胞形态,免疫细胞化学染色对成纤维细胞进行鉴定,作生长曲线观察细胞增殖能力；采用MTS检测粉防己碱不同浓度作用后成纤维细胞增殖影响,并计算不同浓度粉防己碱对成纤维细胞的抑制率。2.取体外分离培养的增生性瘢痕成纤维细胞,将其随机分成四组：对照组、粉防己碱处理组、TGF-β1处理组、混合处理组(粉防己碱+TGF-β1),继续培养；作用48h后：采用RT-PCR检测TGF-β1、Smad2、Smad7、TβRI和TβR Ⅱ基因mRNA表达差异；采用Western blot检测TGF-β1、Smad2和Smad7蛋白表达差异；采用免疫细胞化学染色检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白(Col Ⅰ, ColⅢ)表达差异；细胞经PI染色后,采用流式细胞仪检测各组细胞周期的变化。3.取体外分离培养的增生性瘢痕成纤维细胞,采用siRNA-NC-FAM对成纤维细胞进行转染效率评价,筛选合适的载体进行转染；依据Ambion公司提供的SiRNA设计原则,结合分析已知基因序列和二级结构,确定特异性siRNA,体外转录法构建Smad7的SiRNA,转染增生性瘢痕成纤维细胞,提取RNA检测Smad7表达的强弱改变,证实转染后目的基因沉默；瞬时转染Smad7真核表达载体Lipofectamine TM2000,实验分为三组(空白对照组,Smad7-siRNA组,粉防己碱+Smad7-siRNA组),加入粉防己碱作用48h,用RT-PCR方法比较粉防己碱作用前后HSFs中Smad2、Smad7、TβR Ⅰ、TβRⅡ、和TGF-β1 mRNA表达差异,用west-blot方法检测TGF-β1、Smad2蛋白表达差异。4.取体外分离培养的增生性瘢痕成纤维细胞,应用粉防己碱作用48h,分别对粉防己碱干预后成纤维细胞和正常对照组的mRNA提取、纯化、甲醛变性胶电泳质检后,进行荧光标记、杂交与清洗,扫描荧光信号,以LuxScan 3.0图像分析软件筛选差异表达基因,进一步对差异基因进行Pathway分类的统计分析；以Real time PCR验证芯片结果。统计学处理(二级标题)实验数据用SPSS 13.0统计软件进行统计分析,实验结果以均数±标准差(X±SD)表示,各组数据间的统计采用方差分析,p<0.05为显著性差异。多重比较采用LSD法,p<0.05为显著性差异。结果1.采用组织块贴壁结合胰蛋白酶消化法体外分离人增生性瘢痕成纤维细胞,48h可见组织块周围细胞长出；7d细胞局部融合；14d细胞基本融合。分离培养的成纤维细胞波形蛋白呈阳性表达。传代培养的成纤维细胞5d融合,细胞在1-5d处于指数分裂期。MTS结果显示粉防己碱浓度在2.5μg/ml-12.5μg/ml之间时,可明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖,其作用并呈一定的剂量效应关系,当浓度为5μg/ml时,对成纤维细胞的抑制率为50.72%。2.增生性瘢痕成纤维细胞在粉防己碱作用后,Smad7表达增加而Smad2和TGF-β1表达减少,致使Ⅰ、Ⅲ胶原表达减少,S期成纤维细胞明显减少,而细胞数减少,细胞变圆变小,胞体周边的突触变短或消失；当TGF-β1作用成纤维细胞后,Smad7表达减少而Smad2、TGF-β1、I和Ⅲ型胶原表达表达增加,S期成纤维细胞明显增多,而胞体更大、突触更长；混合处理组结果与粉防己碱组相似；TβR Ⅰ和TβⅡ在各组中均未见显著差异。3.增生性瘢痕成纤维细胞Lipofectamin2000为转染试剂,0.5μl Lipo反转lOpmol siRNA-NC-FAM时能取得良好效果。Smad7沉默后增生性瘢痕成纤维细胞Ⅰ型胶原表达增加；粉防己碱作用Smad7沉默增生性瘢痕成纤维细胞,Smad7 mRNA表达增加而TGF-β1 mRNA表达减少,其他基因表达无显著差异。4.粉防己碱干预前后增生性瘢痕成纤维细胞差异基因比较,差异表达基因有202条,其中上调的基因有184条,下调基因有18条。对筛选的差异基因进行Pathway分类,与TGF-β1信号通路相关涉及蛋白翻译、能量合成和凋亡等25类信号通路,主要为TGF-beta信号通路、Toll样受体通路、PPAR信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路、mTOR信号通路以及p53信号通路等,涉及上调基因31个如DCN,下调基因5个如JUN。Real time PCR结果显示粉防己碱组较照组中JUN的表达量降低,与芯片筛选结果相一致。结论1. 采用组织块贴壁结合胰蛋白酶消化法体外分离培养法可以较快、较好地获得稳定培养的增生性瘢痕成纤维细胞,并筛选出粉防己碱最佳作用浓度,为其形成机制及防治研究提供了实验基础。2.粉防己碱抑制增生性瘢痕成纤维细胞至少部分是通过诱导Smad7表达和下调Smad2来阻断下游信号通路传导,从而抑制Ⅰ、Ⅲ胶原表达和细胞增殖。3. Smad7沉默增生性瘢痕成纤维细胞Smad7对TGF-β/Smads信号通路的负向调控效应降低,而粉防己碱作用后,Smad7 mRNA表达虽有所增加,但不足以达到对信号TGF-β/Smads信号通路的负向调控效应,对成纤维细胞及胶原合成抑制作用不显著。4. 增生性瘢痕成纤维细胞在粉防己碱作用后,可见TGF-beta信号通路、Toll样受体通路、PPAR信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路、mTOR信号通路以及p53信号通路等发生改变,参与了该药物抗纤维化的作用,体现了粉防己碱具有中药多途径与多靶点的作用特点,也进一步说明瘢痕形成中信号通路网络化和复杂性。