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免疫逃逸(immune escape)在肿瘤的发生、发展过程中有着重要的作用,其机制复杂,涉及肿瘤和宿主两方面。从肿瘤角度来说,一方面,肿瘤抗原的缺失、MHC分子的改变、共刺激分子的缺乏等可以使肿瘤免受宿主免疫细胞的识别,从而逃脱抗肿瘤免疫反应;另一方面,肿瘤也可以通过“Fas反击机制”、免疫抑制性分子的分泌等机制主动影响抗肿瘤免疫细胞的增殖活化或功能。人参总皂苷(Gs)、小檗碱(Ber)分别是补益药人参和清热解毒药黄连等的组分,抗肿瘤作用明显。Gs和Ber的抗肿瘤作用机制主要是抑制增殖、诱导凋亡,抑制侵袭和转移,诱导分化等方面,在肿瘤免疫逃逸机制方面的研究尚未见报道。本研究观察了Gs和Ber对人肺癌PG细胞抑制Jurkat T淋巴细胞增殖和促进其凋亡的影响,以及对PG细胞FasL、Fas分子的表达及其TGF-β1、PGE2分泌的作用,以探讨Gs和Ber对肿瘤细胞主动性免疫逃逸机制的影响,为Gs和Ber的抗肿瘤作用机制扩展新的研究内容,并为药物的合理运用提供实验依据。本研究运用人参总皂苷和小檗碱处理肺癌PG细胞24h后进行实验,分组如下:Control组(PG细胞未经药物处理),Gs组(PG细胞经100μg/ml人参总皂苷处理)和Ber组(PG细胞经10μg/ml小檗碱处理)。1.首先建立PG细胞与Jurkat T细胞的共培养体系,观察Jurkat T细胞的生长状况和增殖情况。(1)倒置显微镜下直接观察到,Jurkat T细胞在单独培养情况下成团生长,而Jurkat T细胞与PG细胞共培养24h后呈散在生长;Jurkat T细胞与Gs组和Ber组PG细胞共培养后数目均较Control组明显减少。(2)台盼兰拒染实验结果显示,共培养6h、24h后,Jurkat T细胞活细胞数目明显减少,与单独培养组(Jurkat T组)有统计学差异(P<0.05);而Jurkat T细胞与Gs组PG细胞共培养6h、24h后其生长抑制均较Control组明显,Jurkat T细胞与Ber组PG细胞共培养24h后其生长抑制也与Control组有统计学差异(P<0.01);(3)PG细胞培养上清液与Jurkat T细胞孵育实验结果表明,各组PG细胞培养上清液与T细胞悬液(细胞数不变)的体积比为2:1、1:1、0.5:1时,Jurkat T细胞的生长均受到抑制,大部分组与阴性对照组(Jurkat T组)比较有统计学差异,且呈体积依赖性;各不同体积比组中,Gs组、Ber组与Control组比较均无差异。结果提示,PG细胞对Jurkat T细胞的生长有抑制作用,此作用在人参总皂苷和小檗碱处理PG细胞后更为显著。2.分别用形态学方法和流式细胞术观察和检测了共培养体系中Jurkat T细胞的凋亡。(1)Giemsa染色结果显示,单独培养的Jurkat T细胞形态均一,呈球形,核大,几乎占据整个胞浆,呈均匀的紫黑色;共培养组Jurkat T细胞形态不均一,不规则细胞增多,核可见裂纹及固缩现象;(2)在荧光显微镜下,吖啶橙染色显示:单独培养组Jurkat T细胞的细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光,圆形,形态均一,胞浆呈橘红色或荧光不明显;共培养组Jurkat T细胞形态不均一,可见细胞核绿色荧光呈半月型等固缩形态,并可见呈现弱荧光的细胞。(3)流式细胞术检测结果表明,Jurkat T细胞在单独培养条件下的自然凋亡率较低(早期凋亡率为:5.57%,中晚凋亡率为:4.67%),而各共培养组均表现出较高的凋亡率(早期凋亡率>10%,而中晚期凋亡率为50%左右),两者不管在早期或中晚期差异均有极显著性;而共培养Gs组的Jurkat T细胞早期凋亡率为15.79%,与Control组比较(11.40%)有统计学差异(P<0.05),Ber组凋亡率与对照组无差异;而Gs组、Ber组Jurkat T细胞的中晚期凋亡率与Control组比较差异不明显,但Gs组与Ber组的总凋亡率,即各期凋亡率总和,与Control组比较均有差异(P<0.01,P<0.05)。结果提示,PG细胞可以诱导Jurkat T细胞的凋亡,Gs和Ber均可以促进PG细胞诱导Jurkat T细胞的凋亡。3.免疫细胞化学法检测PG细胞FasL、Fas分子的表达。结果如下(1)肺癌PG细胞有FasL分子的表达,主要分布在胞浆;Gs和Ber均可使PG细胞FasL分子的阳性表达增强。(2)Fas分子在PG细胞也有表达,主要分布在胞浆,胞膜亦有表达;Gs和Ber对Fas分子表达无明显影响。(3)FasL、Fas分子表达的图像分析结果表明,Gs和Ber对FasL分子的表达有上调作用,与对照组比较差异有显著性(P<0.05, P<0.01);Gs对Fas的表达亦有上调作用,而Ber无影响。结果提示,PG细胞有FasL、Fas分子的表达;Gs和Ber能促进FasL和/或Fas的表达。4.运用ELISA法和放射性免疫法分别检测PG细胞培养上清液中转化生长因子β1(TGF-β1)和前列腺素E2(PGE2)的含量。结果显示,PG细胞可分泌TGF-β1和PGE2,100μg/mlGs和5μg/ml、2.5μg/ml Ber均可以促进TGF-β1的分泌;但Gs和Ber各浓度组均对PGE2的分泌无影响。结果提示,PG细胞能分泌TGF-β1和PGE2,Gs和Ber可以促进TGF-β1的分泌,而对PGE2无影响。上述结果表明,肺癌PG细胞能抑制共培养的Jurkat T细胞的增殖并诱导其凋亡,而Gs和Ber能增强肿瘤PG细胞的这种作用,其机制可能与Gs和Ber上调PG细胞凋亡相关分子FasL、Fas的表达以及增加免疫抑制性细胞因子TGF-β1的分泌有关。因此推断,人参总皂苷和小檗碱在抗肿瘤的同时也有可能促进肿瘤的免疫逃逸。