咖啡酸是大肠杆菌中许多冗长代谢途径的重要分支点,可快速穿过细胞膜,为解决共培养过程中间产物咖啡酸积累及细胞毒性问题,实现动态调控,使整个代谢途径达到平衡,本文研究了一个咖啡酸传感器和基于RNAi的双功能动态控制网络,可同时提供上调和下调细胞代谢物。取得的成果如下:基于结构的相似性,本文首先构建了能响应苯酚的基于DmpR转录因子的生物传感器和能响应水杨酸的NahR生物传感器来探究咖啡酸感应系统,通过酶标仪检测荧光强度确定不同浓度诱导物对基因转录的诱导效果。结果表明DmpR传感器对咖啡酸是响应的,随咖啡酸浓度的增加,相对荧光强度也在增加,是转录激活型的,其中加入2 mM咖啡酸后12 h时显示出了约12.5(a.u.)的最高动态范围,而NahR随着咖啡酸浓度的增加基本呈现下降的趋势,因此舍弃对基于NahR传感器的进一步研究。为了进一步提高DmpR传感器对咖啡酸响应的灵敏度、动态范围和稳定性,接下来通过随机突变和定点突变的方式改变结合的能力。最后筛选到两株突变菌F42V和C137A响应的最高动态范围都超过了原始菌株,且在48 h内的动态范围比较稳定。为了确定能否应用于设计的水飞蓟宾合成途径,又测试了合成咖啡酸前体类似物L-多巴、对香豆酸、酪氨酸的响应性,结果表明酪氨酸是没有响应的,L-多巴显示出了约1.8～2.3倍的诱导率,对香豆酸约1.97～2.8倍的动态范围,但与咖啡酸对比,咖啡酸的响应性是明显高于前体物质的,为进一步应用提供了基础。最后在咖啡酸响应的启动子Po控制下通过RNAi动态下调eGFP表达,分别干扰了 eGFP 的 0-100 bp,-50-50 bp,-100-0 bp,21-79 bp,其中干扰0-100 bp,与不添加咖啡酸相比,相对荧光强度在48 h内分别降低了14%,25%,30%,37%;干扰-21-79 bp,相对荧光强度在48 h内分别降低了 7%,16%,40%,46%,表明RNAi和Po启动子调控因子的整合可通过感知不同咖啡酸浓度提供及时的动态下调反应。