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泸州老窖，久享盛名，有“浓香鼻祖，酒中泰斗”之称，是我国十大名酒之一。在传统固态白酒产酯生香历程中，窖泥是孕育酿酒微生物的巨大宝库，是白酒风味酝酿的根蒂。不同种类、数量的窖泥微生物，其种间相互作用及代谢产物不同，这直接影响着浓香型白酒特征风味物质形成的丰富性。浓香型白酒的主体酸成分中，乙酸、丙酸、丁酸及己酸均由窖泥主要产酸细菌产生，其中己酸可与大曲发酵产生的酒精生成己酸乙酯——是浓香型白酒的主体香成分。在一定程度上，己酸菌和窖泥共同决定着浓香型白酒的质量与风格。因此，研究泸州老窖不同窖龄窖泥产酸细菌的多样性具有重要意义。
本研究中，从泸州老窖不同窖龄的不同位置采集窖泥样品共8份，分离纯化获得产己酸细菌，测定其形态学特征及产酸能力，并利用BOXAIR-PCR、16S rDNAPCR-RFLP和16S rDNA序列分析研究其遗传多样性和系统发育特征;进而采用形态学方法与GC-MS方法对高产菌株LZ104、LZ802的生理生化特性和代谢产物进行了初步研究。主要取得了以下结果:
(1)从窖泥样品中共分离筛选获得43株供试细菌。其菌落形态特征:圆形，白色或黄色，不透明，湿润，中心凸起，后期菌落四周褶皱。镜检结果以鼓槌状、梭状短杆和细长杆菌为主，排列整齐;大多数菌株革兰氏染色阳性。
(2)采用硫酸铜法定性测定了供试菌株的产己酸能力，结果表明，供试菌株发酵液加入硫酸铜溶液后，呈现分层现象并产生絮状沉淀，且醚层变蓝，供试的43株细菌均具有产己酸能力，但产己酸能力存在差异。菌株LZ104产酸能力最强，菌株LZ602产酸能力最弱。
(3)BOXAIR-PCR聚类结果表明，供试菌株间存在着明显的遗传多样性，所有菌株在64％相似性水平处聚为一群;在82.2％相似水平处，供试菌株被分为8个BOX遗传群。菌株LZ710单独成群;最大的遗传菌为群Ⅰ，由17株供试菌株组成;其次为遗传菌群Ⅲ和Ⅳ，分别由7个和6个菌株组成。
(4)根据BOXAIR-PCR结果，对供试菌株进行16S rDNA PCR-RFLP分析。结果表明，供试菌株表现出了丰富的遗传类型，包括9种HaeⅢ图谱类型，13种MspⅠ酶切类型和8种HinfⅠ酶切类型。在82.2％相似水平上，供试株菌分为8个群，其中菌株LZ710单独成群。聚类结果与BOXAIR-PCR群聚结果有较好的一致性。
(5)基于产酸的初筛结果选取11株代表菌株，测定了其滴定酸产生情况，结果表明，绝大部分菌株在第5天产酸量达到最高，随后逐渐下降;菌株LZ707在第6天达到产酸高峰值。LZ104产酸量最高，为2.75g/mL，其次为LZ802，为2.54g/mL，LZ209最低，产酸量为0.76g/mL。根据滴定酸产生量最终筛选出2株高产菌株:菌株LZ104和菌株LZ802。
(6)扩增11个供试菌株的16S rDNA片段，测序并构建了其系统发育树。结果表明，供试菌株形成了3个系统发育分支，包括3个属，其中梭菌属（Clostridium）有4个菌株，LZ104与Clostridium fallax(M59088)相似性为92％，LZ802、LZ401与Clostridium tyrobutyricum(M59113)相似性为99％，LZ209与Clostridium novyi(AB045606)相似性为96％;芽孢杆菌属(Bacillus)有6个菌株，LZ102与Bacillus simplex(AJ439078),LZ312与Bacillus circulans(AY724690),LZ508与Bacillus thuringiensis(D16281),LZ707和Bacillusaltitudinis(AJ831842),LZ502与Bacillus licheniformis(CP000002),LZ301与Bacillus subtilis(AJ276351)的相似性达99％;假单胞菌(Pseudomonas)属有1个菌株，LZ304与Pseudomonas mendocina(D84016)相似性为99％。这些菌株主要分布于梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属（Bacillus）和假单胞菌属(Pseudomonas)，其中芽孢杆菌属（Bacillus）为优势属。
(7)高产菌株LZ104细胞杆状，G+，芽孢鼓槌状，有鞭毛，大小0.8-1.0μm×0.25-0.27μm，代时4.34h。半固体培养基中，第3天开始产酸，维持至第13天。高产菌株LZ802细胞杆状或稍有弯曲，G+，芽孢鼓槌状或纺锤状，有鞭毛，大小2.5-4.5μm×1.0-1.5μm，代时3.68h。半固体培养基中，第3天开始产酸，维持至第11天。两株菌株生理生化反应大多为阳性。
(8)对LZ104和LZ802的代谢产物进行了GC-MS测定，结果表明，菌株LZ104发酵液的代谢产物中主要有8种组分，包括酸3种、醇2种、酮3种、吡嗪1种。菌株LZ802发酵液的代谢产物中主要有11种组分，包括酸4种、醇2种、酮2种、酯1种、吡嗪1种与癸烯酰基1种。两株高产菌株的产物组分中丙三醇含量都最高，且二者产丁酸与2，6-二甲基吡嗪的能力都较强，菌株LZ104产酸能力大于LZ802。面积归一化法分析结果为:菌株LZ104发酵液中的酸类、醇类、酮类分别占总香气成分的19.46％、43.10％、36.60％;菌株LZ802的占13.54％、32.42％、13.50％，此外酯类占0.20％。表明其含量总香气成分的大小均排列为:醇类＞酸类＞酮类＞酯类。
本研究中，从泸州老窖不同窖龄的不同位置采集窖泥样品共8份，分离纯化获得产己酸细菌，测定其形态学特征及产酸能力，并利用BOXAIR-PCR、16S rDNAPCR-RFLP和16S rDNA序列分析研究其遗传多样性和系统发育特征;进而采用形态学方法与GC-MS方法对高产菌株LZ104、LZ802的生理生化特性和代谢产物进行了初步研究。主要取得了以下结果:
(1)从窖泥样品中共分离筛选获得43株供试细菌。其菌落形态特征:圆形，白色或黄色，不透明，湿润，中心凸起，后期菌落四周褶皱。镜检结果以鼓槌状、梭状短杆和细长杆菌为主，排列整齐;大多数菌株革兰氏染色阳性。
(2)采用硫酸铜法定性测定了供试菌株的产己酸能力，结果表明，供试菌株发酵液加入硫酸铜溶液后，呈现分层现象并产生絮状沉淀，且醚层变蓝，供试的43株细菌均具有产己酸能力，但产己酸能力存在差异。菌株LZ104产酸能力最强，菌株LZ602产酸能力最弱。
(3)BOXAIR-PCR聚类结果表明，供试菌株间存在着明显的遗传多样性，所有菌株在64％相似性水平处聚为一群;在82.2％相似水平处，供试菌株被分为8个BOX遗传群。菌株LZ710单独成群;最大的遗传菌为群Ⅰ，由17株供试菌株组成;其次为遗传菌群Ⅲ和Ⅳ，分别由7个和6个菌株组成。
(4)根据BOXAIR-PCR结果，对供试菌株进行16S rDNA PCR-RFLP分析。结果表明，供试菌株表现出了丰富的遗传类型，包括9种HaeⅢ图谱类型，13种MspⅠ酶切类型和8种HinfⅠ酶切类型。在82.2％相似水平上，供试株菌分为8个群，其中菌株LZ710单独成群。聚类结果与BOXAIR-PCR群聚结果有较好的一致性。
(5)基于产酸的初筛结果选取11株代表菌株，测定了其滴定酸产生情况，结果表明，绝大部分菌株在第5天产酸量达到最高，随后逐渐下降;菌株LZ707在第6天达到产酸高峰值。LZ104产酸量最高，为2.75g/mL，其次为LZ802，为2.54g/mL，LZ209最低，产酸量为0.76g/mL。根据滴定酸产生量最终筛选出2株高产菌株:菌株LZ104和菌株LZ802。
(6)扩增11个供试菌株的16S rDNA片段，测序并构建了其系统发育树。结果表明，供试菌株形成了3个系统发育分支，包括3个属，其中梭菌属（Clostridium）有4个菌株，LZ104与Clostridium fallax(M59088)相似性为92％，LZ802、LZ401与Clostridium tyrobutyricum(M59113)相似性为99％，LZ209与Clostridium novyi(AB045606)相似性为96％;芽孢杆菌属(Bacillus)有6个菌株，LZ102与Bacillus simplex(AJ439078),LZ312与Bacillus circulans(AY724690),LZ508与Bacillus thuringiensis(D16281),LZ707和Bacillusaltitudinis(AJ831842),LZ502与Bacillus licheniformis(CP000002),LZ301与Bacillus subtilis(AJ276351)的相似性达99％;假单胞菌(Pseudomonas)属有1个菌株，LZ304与Pseudomonas mendocina(D84016)相似性为99％。这些菌株主要分布于梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属（Bacillus）和假单胞菌属(Pseudomonas)，其中芽孢杆菌属（Bacillus）为优势属。
(7)高产菌株LZ104细胞杆状，G+，芽孢鼓槌状，有鞭毛，大小0.8-1.0μm×0.25-0.27μm，代时4.34h。半固体培养基中，第3天开始产酸，维持至第13天。高产菌株LZ802细胞杆状或稍有弯曲，G+，芽孢鼓槌状或纺锤状，有鞭毛，大小2.5-4.5μm×1.0-1.5μm，代时3.68h。半固体培养基中，第3天开始产酸，维持至第11天。两株菌株生理生化反应大多为阳性。
(8)对LZ104和LZ802的代谢产物进行了GC-MS测定，结果表明，菌株LZ104发酵液的代谢产物中主要有8种组分，包括酸3种、醇2种、酮3种、吡嗪1种。菌株LZ802发酵液的代谢产物中主要有11种组分，包括酸4种、醇2种、酮2种、酯1种、吡嗪1种与癸烯酰基1种。两株高产菌株的产物组分中丙三醇含量都最高，且二者产丁酸与2，6-二甲基吡嗪的能力都较强，菌株LZ104产酸能力大于LZ802。面积归一化法分析结果为:菌株LZ104发酵液中的酸类、醇类、酮类分别占总香气成分的19.46％、43.10％、36.60％;菌株LZ802的占13.54％、32.42％、13.50％，此外酯类占0.20％。表明其含量总香气成分的大小均排列为:醇类＞酸类＞酮类＞酯类。