家蚕是鳞翅目昆虫研究的典型代表,同时也是一种重要的经济昆虫。我国约有2000万户蚕农从事蚕业生产,养蚕业是我国农民致富增收的特色产业之一。微孢子虫是一类宿主范围非常广泛的胞内专性寄生的病原真菌,其宿主包括线虫、果蝇、家蚕、兔和人类等,被众多学者喻为―寄生大师‖。迄今为止已鉴定208属,1,400种微孢子虫,其中15种微孢子虫已在艾滋病患者体内分离并鉴定。家蚕微粒子虫（Nosema bombycis）是人类鉴定的第一种微孢子虫,可经口感染家蚕（Bombyx mori）,进入中肠后孢子发芽并弹出极管,孢原质经极管进入宿主细胞,引发家蚕微粒子病（pébrine）,可造成大量家蚕死亡;更为严重的是,家蚕微粒子虫通过侵染家蚕卵巢的方式进入蚕卵,完成其垂直传播,导致胚胎先天性感染,造成更大的经济损失。家蚕微粒子病的流行曾使19世纪欧洲养蚕业陷入绝境,时至今日,该病在中国、印度等养蚕国家依然造成严重的经济损失,故家蚕微粒子虫也是我国蚕种生产中唯一法定检疫对象。鉴于家蚕微粒子虫经卵垂直传播的重要性,本实验室对垂直传播的分子过程进行了系统研究。本论文主要聚焦于垂直传播的下游事件,即先天性感染的家蚕微粒子虫在家蚕胚胎中增殖特征以及其诱导的家蚕免疫应答,目的是揭示家蚕微粒子虫在胚胎中增殖的模式与规律,探明先天性感染的家蚕微粒子虫诱导的家蚕免疫应答的时空特征,为深入阐明微粒子病垂直传播的分子过程以及流行病学规律做出贡献,为微粒子病的防控提供新思路,同时也为其它先天感染病原的研究提供参考。本研究所使用的原始数据已上传NCBI Sequence Read Archive（SRA,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）,登记号:PRJNA549766。本论文的主要研究结果如下:1.先天性感染的家蚕微粒子虫在家蚕胚胎中增殖的时空特征通过病理组织学观察,发现在产卵后1d,有少量未成熟的家蚕微粒子虫随机分散于胚带和卵黄颗粒周围;产卵后2d,发现具有几丁质壳的家蚕微粒子虫,即成熟的家蚕微粒子虫,同时发现胚胎组织细胞间有少量感染;产卵后3d,家蚕微粒子虫在卵黄颗粒周围大量增殖;产卵后4d,胚体进入反转前期,形成肠腔,此时家蚕微粒子虫随卵黄颗粒一起被裹进肠腔;产卵后5d-9d,家蚕微粒子虫增殖的主要部位为胚体外的卵黄颗粒周围及胚体的肠腔;最终,蚁蚕孵化,其肠腔中积累的大量成熟的家蚕微粒子虫随蚕沙排出体外,污染蚕座,进行水平传播。通过透射电镜观察,在发育中期胚胎的卵黄颗粒周围发现了具有完整孢壁的家蚕微粒子虫。胚胎发育8d,发现成簇存在的极管排列整齐且孢壁光滑的成熟家蚕微粒子虫。最终在新孵化的蚁蚕中发现家蚕微粒子虫在细胞内寄生增殖现象,即在一个宿主细胞中含有多个裂殖体和正在成熟的家蚕微粒子虫。2.先天性感染的家蚕微粒子虫在家蚕胚胎中增殖的转录组特征分析制备的先天性感染蚕卵经催青后,在家蚕胚胎发育的不同时间点进行取样,开展转录组测序工作,挖掘病原与宿主的基因表达特征。家蚕胚胎发育过程中7个时间点样本共获得588.30Gb数据,其中比对到家蚕参考基因组唯一位置的Reads数为2,345,559,311,比对到家蚕微粒子虫参考基因组唯一位置的Reads数为5,759,867。家蚕幼虫期2个时间点样本共得到95.73Gb数据,其中比对到家蚕参考基因组唯一位置的Reads数为510,931,457,比对到家蚕微粒子虫参考基因组唯一位置的Reads数为32,477,522。使用q RT-PCR对差异表达基因进行验证,定量结果与RNA-Seq结果吻合率为70%,说明转录组测序结果较为可信。本部分主要分析了病原基因的转录特征,获得了3,644个家蚕微粒子虫基因的转录信息,占其已注释基因的81.7%。不同胚胎发育时间点的家蚕微粒子虫读取数据占总读取数据0.07%至0.89%不等。根据家蚕微粒子虫转录组主成分分析（Principal component analysis,PCA）,发现产卵后1d、26h及产卵后2d这三组样本中,家蚕微粒子虫基因的转录数据特征较为接近,聚为一簇;产卵后4d样本的数据单独聚类,产卵后6d、8d、9d样本的家蚕微粒子虫基因转录数据聚为一簇。通过对高转录基因分析（Top 100 highly expressed）,发现家蚕微粒子虫增殖过程中持续高转录的41个基因主要由核糖体蛋白、组蛋白、转录因子、热激蛋白、孢壁蛋白以及假定蛋白组成。同时统计分析了家蚕微粒子虫分泌蛋白组基因（预测含有信号肽的基因）的转录情况,获得了332个基因的转录信息,其中有249个蛋白注释为假定蛋白;对在所有的时间点持续转录且同时具有注释的65个核心分泌蛋白进行了分析,其中包括孢壁蛋白、极管蛋白、ADP/ATP carrier protein 1以及Serpins,Ricin B lectin等。对可能作为病原效应分子的Serpin家族分析后发现,Serpin 2,Serpin 3,Serpin6,Serpin 10具有相对较高的转录量。依据病理组织学的观察结果,结合上述家蚕微粒子虫总体转录特征以及各时间点高转录基因（TOP 100）中孢壁蛋白基因数进行分析,我们推测:产卵后1d、26h和2d,蚕卵中的家蚕微粒子虫以裂殖增殖期为主;产卵后6d、8d和9d的样本中,家蚕卵中的家蚕微粒子虫以孢子增殖期为主;而产卵后4d,蚕卵中家蚕微粒子虫以裂殖增殖为主到以孢子增殖为主过渡。3.先天感染家蚕微粒子虫后家蚕胚胎与幼虫的转录组分析本部分主要分析了家蚕微粒子虫先天性感染诱导的宿主基因转录特征。首先,对宿主差异表达基因（FDR≤0.01,Fold change≥2）分析发现,先天性感染的家蚕微粒子虫对胚胎的影响较弱,在胚胎期7个时间点共发现527个差异基因,其中有365个上调基因,163个下调基因。根据差异基因火山图,发现胚胎期差异基因数量主要集中在产卵后26h（314个）,而其它时间点差异基因数量较少。在产卵后26h,caspase 8,dual oxidase,juvenile hormone esterase和Kruppel homolog 1等253个基因显著上调,C-type lectin 16,serine protease inhibitor 10等61个基因显著下调。此外表皮相关基因在产卵后1d、6d显著上调,但是在产卵后4d显著下调。产卵后9d即出蚁第一天,lipase 3,facilitated trehalose transporter Tret1-like,pancreatic triacylglycerol lipase,alkaline phosphatase等基因显著下调。根据相关性分析,发现胚胎期相同时间点的正常组样品与感染组样品转录组数据均聚为一枝,再次说明家蚕微粒子虫对胚胎的影响较弱。与胚胎期相反,在幼虫期2个时间点共发现多达2671个差异基因,其中有1578个上调基因,1093个下调基因。根据GO富集分析,发现幼虫5d与幼虫10d的正常组与感染组的宿主差异基因主要涉及代谢过程、细胞过程、单一生物过程、膜、膜组分、细胞、细胞组分、细胞器、结合、催化活性、结构分子活性等二级分类。4.先天感染家蚕微粒子虫后家蚕胚胎与幼虫的先天免疫应答分析本部分系统分析了家蚕胚胎期与幼虫期的先天免疫通路相关基因的转录特征,包括病原识别、信号调节、信号转导以及效应因子等。对胚胎期免疫相关基因的比较分析发现,仅βGRP1,SCRC,defencin三个免疫相关基因为差异显著基因。胚胎期免疫相关基因转录的共同特征是转录的基因数量少,且转录水平较低,上下调差异不显著,未得到MYD88的转录信息。并且在孵化前,未检测到多数抗菌肽基因的转录信息。此外,感染组和对照组相比,溶菌酶、黑化通路相关基因虽存在转录差异,但差异不显著。在感染的新生蚁蚕中（产卵后9d）,已发现cec A1,glv3等抗菌肽基因的转录,但和对照组相比,差异也不显著。以上数据表明:胚胎孵化前的先天免疫系统尚未完全建立,微孢子虫的先天性感染引起的胚胎免疫应答极弱。与此相反,幼虫期转录数据显示,大量免疫相关基因显著性差异转录。例如病原识别过程中,βGRP 2,PGRP S1,PGRP S3,PGRP S5,PGRP S6,CTL 9和CTL19转录上调,CTL 1,CTL 2,CTL 4,CTL 7,CTL 12,CTL 16和CTL 18转录下调;信号调节过程中,CLIP 4,CLIP 11,CLIP 12,SPN 5,SPN 7,SPN 19和SPN 22转录上调,CLIP 5,CLIP 14,SPN 10,SPN 12,SPN 15和SPN 17转录下调;信号转导过程中,Toll 9-1和TRAF 3转录上调,Cactus转录下调;在效应因子中有cec,glv,mor LP等13个抗菌肽基因转录上调。这些数据表明家蚕的先天免疫系统在幼虫期已完全建立,且家蚕微粒子虫先天感染诱导了家蚕幼虫强烈的先天免疫应答。综上所述,本研究通过病理组织学观察与系统的转录组数据分析,首次描绘了家蚕微粒子虫在胚胎中增殖的时空特征,包括其形态特征及基因动态转录特征,并比较分析了家蚕微粒子虫先天感染诱导的家蚕胚胎与幼虫的时期差异性免疫应答,基本阐明了家蚕微粒子虫垂直传播下游事件,深入理解了微孢子虫先天性感染的致病过程,为研究家蚕胚胎免疫系统的发育及其与病原的相互作用,提供了详实的数据,也为蚕业生产中微粒子病的防控提供了新思路。