研究背景:卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,死亡率居妇科肿瘤首位。90-95%以上的卵巢癌起源于卵巢表面上皮。由于上皮性卵巢癌(Epithelial Ovarian Cancer,EOC)起病隐匿,进展快,且缺乏有效的早期诊断手段,约70%的患者一经发现即已为晚期。虽然近年来手术、化疗和放疗获得重大进展,但晚期上皮性卵巢癌的五年生存率依旧仅为20%-30%。因此,临床上迫切需要更敏感的肿瘤标志物和有效的治疗手段来识别高危患者并改善患者预后。免疫监视学和免疫逃逸学是免疫系统参与肿瘤发生发展的两大学说。2013年,Chen等认为,机体肿瘤免疫反应的诸多环节中,有很多免疫细胞及因子参与其中,这也为免疫治疗提供了广泛的潜在治疗靶点。因此,我们认为机体免疫功能在监测和消灭肿瘤细胞中起着重要的,不可或缺的作用。而在上皮性卵巢癌的发生、发展中,Th细胞亚群、调节性T细胞亚群及相关细胞因子失调扮演着重要角色。辅助性T细胞(Th1,Th17)和调节性T细胞(Treg)对机体免疫系统有重要的调节作用,Th22细胞亚群是新近发现的一种CD4+T细胞新亚群(T辅助细胞,T-helper cell),是独立于Th1,Th2、Th17的CD4+T细胞亚群,其具有稳定的效应因子体系和独特的信号转导方式,可表达CCR6、CCR10和CCR4,并分泌效应因子白细胞介素22(Interleukin22,IL-22)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-13。在特定的IL-6和TNF-α的存在下,初始性T细胞可以向Th22的表型方向分化最终形成Th22细胞群。其还可选择性的表达转录因子,包括PDGF受体和CCR-10。Th22细胞参与多种肿瘤的发生发展,包括直肠癌,胃癌,肝癌,肺癌等。而这个新的T淋巴细胞亚群最为关键的转录因子是AHR,重要的效应因子包括白细胞介素22和肿瘤坏死因子α。白介素22是属于白介素10家族细胞因子,IL-22与IL-10是有同源性的,其同源性在人是25%,在小鼠是22%。IL-6和TNF-α诱导CD4+初始T细胞向Th22 细胞分化,而转化生长因子 β(Transforming growth factor β,TGF-β)则抑制Th22细胞的分化。IL-22受体(IL-22R)复合物是由IL-10R2和IL-22R1两条链组成的异源二聚体跨膜蛋白。IL-22先与IL-22R1结合,随后IL-10R2结合到IL-22/IL-22R1复合物上。IL-22作为一个炎性细胞因子,在结肠癌、肝癌、胃癌、肺癌、胰腺癌、口腔鳞状细胞癌、皮肤恶性肿瘤等肿瘤中有着重要的作用,提示肿瘤与炎症之间联系密切,而炎性细胞因子在肿瘤的发生、发展过程中具有重要的意义。TNF-α也称为恶病质素,是单核细胞和巨噬细胞分泌的一种多功能细胞因子,具有诱导肿瘤退行性变和抑制肿瘤细胞生长的作用。TNF-α由157个氨基酸组成,具有促进肿瘤及抑制肿瘤的双重作用。研究TNF-α在肿瘤发生发展中的分子机制,可发挥它的抑制肿瘤功能,为肿瘤的免疫治疗提供有效的预防和治疗靶点。我们知道,TNF-α参与卵巢癌的发生发展变化是通过多种机制进行的:1.TNF-α可促进肿瘤中主要组织相容性复合物(MHC)-Ⅰ,肿瘤抗原提呈蛋白的表达升高。并且TNF-α可促进卵巢表面的上皮细胞增殖,并抑制卵巢癌细胞的生长。2.TNF-α通过自分泌和旁分泌发挥双重作用。巨噬细胞分泌的TNF-α可诱导内源性TNF-αmRNA表达,通过这种自分泌促进卵巢癌细胞的增殖。而TNF-α并非参与卵巢癌细胞生长的全过程,有时只提供旁分泌生长刺激。3.TNF-α与肿瘤靶细胞上的TNF-α受体结合,随之活化TNF-α受体,从而传导死亡信号,激活磷脂酶A2,分泌超氧化物,导致DNA断裂无法合成。研究证明细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)活性在细胞对 TNF-α的敏感度上有一定的调节作用,并且,ERK的激活和JUK的激活存在一定的平衡,体现卵巢癌细胞对TNF-α的反应情况。4.TNF-α可引起肿瘤组织血管内皮细胞损伤,进一步导致血栓形成和血管破裂等情况。迄今为止,Th22细胞及IL-22在卵巢癌中的作用及其与Th17、Th1细胞的关系还未见报道。目的:为了解Th细胞、Treg细胞及其相关细胞因子在EOC中的表达及临床意义,通过流式细胞技术检测EOC,良性上皮性卵巢肿瘤病人和健康人对照组外周血中Th22,Th17,Th1以及Treg细胞的表达的情况,并通过ELISA检测相应血浆中IL-22、TNF-α、INF-γ及IL-17的表达情况;利用qPCR、Western Blot检测EOC,良性上皮性卵巢肿瘤病人和健康人对照组组织中IL-22、TNF-α、INF-γ、IL-17及IL-22R1和IL-10R2的表达情况。并将检测结果与EOC相应的临床病理分期及组织学分级进行了分析,研究各细胞群与细胞因子表达水平和疾病的发生发展之间的关系,进一步探讨Th22细胞与EOC发生发展之间存在的关系,为今后疾病的的早期诊断和治疗起到积极的指导作用。材料和方法:(1)选取34例EOC患者,15例良性上皮性卵巢肿瘤患者和15例健康人为研究对象,于无菌条件下抽取外周血进行流式细胞学检验,同时储存应用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)进行细胞因子的检测。(2)取全血进行乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA,phorbol myristate acetate),莫能霉素和离子霉素刺激4小时,应用流式细胞仪染色法检测外周血淋巴细胞血表面分子CD4和CD25的表达以和细胞内细胞因子IL-22,IL-17,叉头框蛋白P3(Forkhead box protein P3,FOXP3)和 IFN-γ的表达,从而检测外周血中 Th22(CD4+IFN-γ-IL17+IL22+T cells),Th17(CD4+IL17+IFN-γT cells),Treg(CD4+CD25+Foxp3+T cells)以及 Th1(CD4+IFN-γ+T cells)细胞的表达情况。(3)采集所有研究对象血浆,应用ELISA检测IL-22,TNF-α,IFN-γ和IL-17的细胞因子水平。(4)对Th细胞及其相关细胞因子的表达进行了临床分析。根据病理分期将上皮性卵巢癌病人分为两组(Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期、Ⅳ期),根据组织学分级将EOC患者分为三组(低分化、中分化、高分化)。分析了 Th细胞及其相关细胞因子在不同分组中的表达是否存在差异。(5)取EOC,良性上皮性卵巢肿瘤病人和健康人对照组组织,利用qPCR、Western Blot检测EOC,良性上皮性卵巢肿瘤病人和健康人对照组组织中IL-22、TNF-α、INF-γ、IL-17 及 IL-22R1 和 IL10R2 的表达水平。结果:(1)将实验对象的外周血经过刺激液短时间刺激培养后,进行细胞的流式抗体标记,应用流式细胞学检验发现在EOC患者外周血中,Th22细胞的表达(2.57±0.88%)较良性上皮性卵巢肿瘤病人(0.87±0.21%)和健康对照组(0.82±0.12%)显著升高(P<0.05);另外,在EOC患者外周血中,Th17细胞的表达(3.15± 1.35%)较良性上皮性卵巢肿瘤病人(1.06±0.26%)和健康对照组(1.04±0.17%)显著升高(P<0.05);然而EOC患者、良性上皮性卵巢肿瘤病人和健康对照组的外周血中Treg的水平之间无显著差异(P>0.05);同样的,Th1细胞的水平在上皮性卵巢癌病人(27.04±12.21%)、良性上皮性卵巢肿瘤病人(20.14±1.49%)和健康对照组(20.36±1.45%)之间没有显著差异(P>0.05)。(2)应用ELISA法对血浆中的IL-22,TNF-α,IFN-γ和IL-17细胞因子进行检测,实验结果表明在EOC患者血浆中,IL-22的水平(34.19±4.58pg/mL)较良性上皮性卵巢肿瘤病人(23.1±1.78pg/mL)和健康对照组(22.1±1.71pg/mL)显著升高(P<0.05);EOC 患者血浆中,TNF-α的水平(median,114;range,5.50-595pg/mL)较良性上皮性卵巢肿瘤病人(median,7.15;range,4.31-9.31pg/mL)和健康对照组(median,6.32;range,3.76-9.31pg/mL)显著升高(P<0.05);然而上皮性卵巢癌病人、良性上皮性卵巢肿瘤病人和健康对照组的血浆中IFN-γ的水平之间无显著差异(P>0.05);同样的,IL-17的水平在EOC患者、良性上皮性卵巢肿瘤病人和健康对照组之间没有显著差异(P>0.05)。(3)实验结果显示,在EOC患者外周血中,Th22细胞水平与Th17细胞水平之间呈正相关性(r=0.534,P=0.001);同样的,Th22及Th17细胞水平与Th1细胞水平之间也呈正相关性(r=0.464,0.541;P=0.006,0.001);然而,Treg细胞和Th22细胞,Th17细胞以及Th1细胞之间没有关联(P>0.05)。(4)实验结果显示,在EOC患者外周血中,Th1细胞水平与IFN-丫水平之间呈正相关性(r=0.418,P=0.014);同样的,Th22细胞水平与IL-22及TNF-α水平之间也呈正相关性(r=0.585,0.495;P=0.001,0.009)。(5)在EOC病人中,病理分期Ⅲ-Ⅳ期的病人外周血中Th22细胞的表达(2.77±0.91%)明显高于病理分期为Ⅰ-Ⅱ期的病人(1.91±0.23%,P=0.012);病理分期Ⅲ-Ⅳ期的病人外周血中IL-22的表达(35.6±3.98pg/mL)显著高于病理分期Ⅰ-Ⅱ期的病人(29.8±3.61pg/mL,P=0.002);病理分期Ⅲ-Ⅳ期的病人外周血中TNF-α的表达(median,133.2,range5.50-595pg/mL)显著高于病理分期 Ⅰ-Ⅱ 期的病人(median,51.6,range 21.6-109.5pg/mL,P=0.01);同时,我们发现 Th17、Th1、IL-17和IFN-γ的表达在EOCⅢ-Ⅳ期病人和Ⅰ-Ⅱ期病人之间没有明显差别(P>0.05)。并且,Th22、Th17、Th1、IL-22、IL-17、TNF-α和 IFN-γ的表达在不同组织学分级之间没有明显差异。(6)利用qPCR检测mRNA,Westem Blot检测蛋白水平,在EOC患者中,IL-22的表达显著高于BOEN组(P<0.001)和HC组。IL-22的表达在BOEN和HC无统计学差异(P>0.05)。EOC患者中,TNF-α的表达显著高于BOEN组(P<0.001)和HC组(P<0.001)。TNF-α的表达在BOEN和HC无统计学差异(P>0.05)。IFN-γ的表达在EOC,BOEN和HC组之间无统计学差异(P>0.05)。IL-17的表达在EOC,BOEN和HC组之间无统计学差异(P>0.05)。表明IL-22和TNF-α的表达在EOC组织中是明显升高的。(7)EOC患者组,良性卵巢上皮性肿瘤病人组和健康对照组组织IL-22R1和IL-10R2进行mRNA PCR的检测各组组织标本中IL-22R1和IL-10R2的表达水平。发现EOC患者中,IL-22R1的表达显著高于BOEN组(P<0.001)和HC组(P<0.001)。IL-10R2 的表达显著高于 BOEN 组(P<0.001)和 HC 组(P<0.001)。IL-22R1 和 IL-10R2 的表达在 BOEN 和 HC 无统计学差异(P>0.05)。Western Blot在蛋白水平的检测,发现EOC患者中,IL-22R1的表达显著高于BOEN组(P<0.001)和 HC 组(P<0.001),IL-10R2 的表达显著高于 BOEN 组(P<0.001)和HC组(P<0.001)。IL-22R1和IL-10R2的表达在BOEN和HC无统计学差异(P>0.05)。结论:(1)在EOC患者中,其外周血中Th22细胞以及Th17细胞水平较良性上皮性卵巢肿瘤及健康对照组是异常升高的;(2)EOC患者血浆中的IL-22和TNF-α水平较良性上皮性卵巢肿瘤及健康对照组是异常升高的,并且随着Th22细胞的升高,IL-22和TNF-α水平也与之发生相应的升高;(3)在EOC患者中,随着EOC患者病情的进展其外周血中的Th22细胞和IL-22和TNF-α水平表达也相应的升高,这说明其外周血升高的Th22细胞及其相关细胞因子与该疾病的发展有关联;(4)IL-22和TNF-α的表达在EOC组织中是明显升高的;(5)IL-22R1和IL-10R2在EOC组织中的表达水平明显升高。意义:本研究揭示在EOC患者外周血中,T细胞亚群Th22细胞和及其相关细胞因子呈现显著升高趋势,并且随着病情的加重,Th22细胞和IL-22、TNF-α的表达也相应的升高,这提示了 Th22细胞及其相关细胞因子在EOC中发生发展过程中可能发挥着一定的作用。