【摘 要】
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目的:针对FOS基因的编码区,设计出靶向FOS基因CRISPR编辑位点,选用适用于人类基因组编辑的PX330质粒并对其脱靶率进行评估。考察CRISPR/Cas系统对人胚胎干细胞的基因编辑情况,以及探寻H1-FOS-Knockout敲除细胞系对其多能性维持有无影响。考察H1-FOS-Knockout敲除细胞系对造血分化的影响。方法:一、CRISPR-Cas9-FOS系统的构建及其功能、脱靶率的评估通
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目的:针对FOS基因的编码区,设计出靶向FOS基因CRISPR编辑位点,选用适用于人类基因组编辑的PX330质粒并对其脱靶率进行评估。考察CRISPR/Cas系统对人胚胎干细胞的基因编辑情况,以及探寻H1-FOS-Knockout敲除细胞系对其多能性维持有无影响。考察H1-FOS-Knockout敲除细胞系对造血分化的影响。方法:一、CRISPR-Cas9-FOS系统的构建及其功能、脱靶率的评估通过 CRISPR 网站（http://crispr.mit.edu/）提供的 sgRNA 序列,针对 FOS基因的四个外显子设计出编辑位点,选择评分最高脱靶率你最低的sgRNA序列,并构建CRISPR-Cas9-FOS系统,采用电转的方法将其导入到人胚胎干细胞当中。然后种单个细胞克隆,待克隆形成后,部分细胞提取基因组,对靶向位点采用PCR扩增,并送测序,验证靶向位点有无发生突变。然后,选取H1-FOS-knockout细胞系检测脱靶率。利用脱靶在线评估网站（http://crispr.cos.uni-heidelberg.de）,预测其潜在的脱靶位点,然后综合选取分值排名前10个潜在脱靶的位点,然后分别针对易脱靶位点设计相应的上下游引物,进行PCR扩增,PCR产物送测序,检测该位点否存在脱靶现象。二、CRISPR-Cas9系统基因敲除FOS对人胚胎干细胞多能性的影响为了以后能进一步探寻H1-FOS-knockout细胞系及其细胞功能,首先应针对其是否能继续维持其自我复制及分化为多种其他细胞的功能进行研究。细胞形态,核型及多能性基因表达情况等方面我们获得的H1-FOS-knockout细胞系与H1-wt表现一致,同时我们也进行了体外EB拟胚体随机分化及小鼠体内畸胎瘤实验对该株细胞进行了研究。三、H1-FOS-knockout细胞系对造血分化的影响基于以往实验,我们知道FOS基因在许多细胞功能中发挥重要作用,而其对造血的影响依然存在矛盾的实验结果。针对这一情况,我们设计了单层造血分化实验,考察H1-FOS-knockout细胞系在造血分化中的作用。结果:一、CRISPR-Cas9-FOS-Konckout质粒构建成功并完成功能验证及脱靶率检测二、H1-FOS-knockout对细胞多能性维持无明显影响结论:成功构建了 CRISPR-Cas9-FOS质粒并将其导入到细胞中,共获得四株细胞H1-FOS-knockout双敲细胞系,并选择了其中两株（H1-FOS-knockout-25,H1-FOS-knockout-37）细胞株对其进行脱靶率及功能的研究。两株细胞在分值较高的10个潜在脱靶的位点均无脱靶,其在细胞形态及核型等方面与H1-wt细胞系无明显差异,且均具有分化为三胚层的潜能。同时在单层分化实验中,我们发现其能增加生血内皮的形成,这一实验结果为后续进一步研究FOS基因在造血过程中作用的研究及提高体外造血效率奠定了基础。
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