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如何充分利用生殖资源保存女性的生育能力，是一个值得研究的重要课题。数以万计的原始卵泡是哺乳动物生殖资源的储备库，而在雌性个体的一生中只有极少部分卵泡发育成熟并排卵，绝大多数卵泡在不同的发育阶段闭锁，如果能够充分利用这部分卵泡，将为我们提供大量宝贵的卵子资源。然而，由于我们对原始卵泡向初级卵泡转化机制的了解甚少，迄今尚未能有效地利用卵巢内大量处于较早发育阶段的卵泡，限制了卵泡体外培养这项技术的开展及临床应用。有学者研究发现，神经营养因子如血管活性肠肽(VIP)能诱导新生大鼠卵巢FSH受体、芳香化酶mRNA和蛋白质的表达，抑制体外培养的大鼠窦前卵泡颗粒细胞的凋亡，促进卵巢类固醇激素的合成，可能在调节非促性腺素依赖的卵泡发育与生长方面发挥着重要作用。
基于目前神经递质VIP对卵泡发育影响的研究进展，我们通过添加含不同浓度VIP的培养基进行新生大鼠卵巢体外培养，组织学、PCNA免疫组化及TUNEL凋亡分析原始卵泡的生长发育情况，探讨不同浓度的VIP对离体原始卵泡生长发育的影响。
材料与方法:
1.动物来源：
雌性SD大鼠购自中山大学药学院实验动物中心，清洁级，出生4天，体重10-15g。
2.实验方法：
取自新生4天大鼠的卵巢，随机分为六组：新鲜组、基础培养组、VIP10-6M组、VIP10-7M组、VIP10-8M组、VIP10-9M组。新鲜组未经培养，直接固定、包埋、切片、染色进行病理学检查；基础培养组以无血清基础培养液(0.1％ BSA、0.1％ALBUMAX、1％ITS-X、0.05mg/ml抗坏血酸、青霉素50U/ml，链霉素50μg/ml)培养；VIP10-6M组、VIP10-7M组、VIP10-8M组、VIP10-9M组分别在上述基础培养液中加入10-6M、10-7M、10-8M、10-9M浓度的VIP后培养。在37℃、5％CO2培养箱中培养14天，每48小时更换培养液一次，每次300μ1。培养结束后做病理切片，行组织形态学检查、PCNA免疫组化和TUNEL凋亡分析。
结果:
1.VIP对体外培养卵巢中早期卵泡生长发育的影响
新鲜组卵巢切片显示，0级卵泡(原始卵泡)在全部卵泡所占的比例为59.72％±1.96％，1级卵泡(早期初级卵泡)23.04％±1.94％，2级卵泡(初级卵泡)7.39％±1.40％，3级卵泡(转化期卵泡)3.6％±1.13％，异常卵泡6.26％±1.64％。
培养后，各培养组不同时期卵泡所占比例与新鲜组比较有统计学差异(P<0.05)，培养过程中原始卵泡的百分比减少，生长卵泡和异常卵泡的百分比增加，且各培养组的1级卵泡(早期初级卵泡)百分比明显高于新鲜组，VIP10-7M组最高，基础培养组最低。4个不同浓度VIP组各时期卵泡所占比例与基础培养组比较有统计学差异(P<0.05)，VIP可增加生长卵泡百分比，减少异常卵泡百分比；其他VIP浓度组与VIP10-7M组比较有统计学差异(P<0.05)，VIP10-6M组和VIP10-9M组的生长卵泡百分比显著低于VIP10-7M组(P<0.05)，VIP10-9M组异常卵泡百分比显著高于VIP10-7M组(P<0.05)。
2.PCNA免疫组织化学染色评估卵泡生长情况
各组卵泡PCNA阳性率：新鲜组为37.39％±2.52％，基础培养组、VIP10-6M组、VIP10-7组、VIP10-8M组和VIP10-9组分别为61.85％±2.72％、67.96％±6.02％、73.99％±4.37％、67.44％±4.68％和67.32％±7.12％。各培养组与新鲜组比较有统计学差异( F=56.85，P<0.001)；不同浓度VIP组与基础培养组比较有统计学差异( F=5.46，P=0.002)；其他VIP浓度组与VIP10-7组比较有统计学差异(F=3.59，P=0.043)，VIP10-7M时卵泡PCNA阳性率最高，VIP10-6M次之，VIP10-8M与VIP10-9最小。
3.VIP对卵泡凋亡的影响
新鲜组极少出现TUNEL阳性染色的原始卵泡和早期初级卵泡，而各培养组TUNEL染色阳性的卵泡广泛存在于各个不同生长时期。
各组卵泡的凋亡指数(AIF)分别为：新鲜组7.98％±2.83％、基础培养组30.78％±6.98％、VIP10-6M组24.48％±2.83％、VIP10-7组21.06％±6.32％、VIP10-8M组26.25％±3.67％和VIP10-9M组27.54％±1.49％。总体方差显示各培养组与新鲜组比较有统计学差异( F=26.81，P<0.001)，且新鲜组最低，培养组中VIP10-7M组最低；各VIP处理组与基础培养组比较有统计学差异( F=4.62，P=0.004)，且VIP10-6M组和VIP10-7M组的卵泡凋亡指数与基础培养组有统计学差异(p<0.05)，其中VIP10-7 M组卵泡凋亡指数最低；各VIP浓度组间有统计学差异( F=3.96，P=0.018)，且VIP10-8M组(p<0.05)和VIP10-9M组(p<0.01)与VIP10-7M组有统计学差异。虽不能说明VIP10-7M组和VIP10-6M组浓度的优劣(P>0.05)，但从卵泡凋亡指数看，VIP10-7M优于VIP10-6M及其他VIP处理组。
结论:
1.新生大鼠完整卵巢体外培养过程中，VIP可以促进新生4天大鼠的原始卵泡向初级卵泡的转化。
2.不同浓度的VIP均可降低卵巢组织卵泡细胞的凋亡，提高卵泡体外存活能力，VIP10-7M较其他浓度更明显地促进卵泡细胞的增殖，降低卵泡细胞的凋亡。