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流感病毒主要感染呼吸道上皮细胞,通过呼吸道黏膜进入动物和人体。因此,黏膜免疫在预防流感病毒感染的研究领域中显得尤为重要。本研究在鸡胚中进行流感病毒的培养,收获病毒后进行灭活、浓缩及纯化得到流感全病毒灭活抗原,经裂解后得到流感病毒裂解抗原。将全病毒灭活抗原分别与霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin B, CTB)、蛋白体(Proteosomes)、氢氧化铝(Al(OH)3)三种佐剂配伍,将裂解病毒分别与上述三种佐剂配伍,进一步探讨其滴鼻免疫小鼠和豚鼠后诱导的免疫效果,最后通过比较筛选出最有效的流感黏膜疫苗。1.本试验从流感病毒的培养,浓缩,纯化等方面优化了制备流感全病毒灭活抗原的条件。试验采用鸡胚培养流感病毒,A型病毒在33℃孵箱中培养56 h,B型病毒在33℃孵箱中培养72 h,收获病毒后,用终浓度为0.02%的甲醛4℃灭活12 h,采用截流分子量为10 ku的超滤膜包进行流感病毒的浓缩,浓缩倍数大约控制在25～30倍之间,之后采用非连续蔗糖密度梯度液(从离心管底向上依次为60%,45%,30%的蔗糖溶液), 4℃,30000 r/min,离心2 h,纯化浓缩的病毒液,透析去糖,PEG浓缩后得到最终的单价灭活病毒液。流感病毒裂解抗原制备方法基本同流感全病毒灭活抗原。我们所采用的裂解剂是终浓度为5%的Triton X-100,20℃,裂解12 h。经过灭活验证试验,单向免疫扩散试验、电镜分析等一系列鉴定,用该套方法制备的流感全病毒灭活抗原可用于后续试验。2.在流感全病毒抗原组中,单独以流感全病毒抗原滴鼻免疫小鼠,其sIgA以及HAI水平均高于各佐剂组,说明,单独以流感全病毒抗原滴鼻免疫小鼠,不但刺激机体产生体液免疫应答,且诱导了机体的黏膜免疫应答;而在流感裂解病毒抗原组中,以蛋白体为佐剂的流感裂解抗原滴鼻免疫小鼠,引起的特异性血清IgG、IgA、IgM及HAI明显高于流感裂解抗原单独滴鼻组及其余佐剂组,说明以蛋白体作为佐剂可显著提高抗原的免疫原性,刺激机体产生较强的体液免疫应答,而且诱导呼吸道黏膜产生sIgA,加强了机体的局部黏膜免疫应答,这对于流感病毒的抗感染免疫具有关键作用。3.用不同剂量的蛋白体-三价流感裂解抗原和三价流感裂解抗原滴鼻免疫小鼠,结果显示:佐剂组中,当免疫剂量达到4μg/只时,可显著提高小鼠血清IgG,IgM以及HAI水平,小鼠脾脏T淋巴细胞CD4+/CD8+值显著高于其余各试验组,说明,该剂量组机体体液免疫反应强于其余各剂量组,且不引起免疫抑制;佐剂组中,当免疫剂量达到4μg/只时,呼吸道黏膜抗体sIgA水平明显升高,说明,该剂量组黏膜免疫反应明显高于其余各剂量组;无佐剂组,各剂量组各项检测指标均处于较低水平,说明,单独以三价流感裂解抗原滴鼻免疫小鼠,仅能刺激机体产生微弱的免疫反应;在相同剂量条件下,佐剂组各项检测指标均显著高于无佐剂组,说明,蛋白体作为流感裂解抗原的佐剂滴鼻免疫小鼠,可明显提高机体的系统免疫应答和黏膜免疫反应。4.以不同剂量三价流感全病毒抗原滴鼻免疫小鼠,在一定抗原剂量范围内,血清IgG、HAI以及sIgA呈现抗原剂量依赖性,即随抗原剂量的加大,各项检测指标水平升高,当免疫剂量达到8μg/只时,血清IgG、HAI以及sIgA达到峰值,抗原剂量再次加大时,各检测指标出现下降,说明8μg/只剂量组可明显提高机体系统免疫应答和呼吸道黏膜免疫应答。而小鼠脾脏T淋巴细胞CD4+/CD8+值随抗原剂量的加大而降低,当免疫剂量达到8μg/只时,CD4+/CD8+值达到最低值,再次提高抗原剂量时,该值回升,说明,8μg/只剂量组可明显提高机体的细胞免疫应答。以不同剂量三价流感全病毒抗原滴鼻免疫豚鼠,6μg/只剂量组各项指标明显低于10μg/只和20μg/只剂量组,而10μg/只和20μg/只剂量组各项检测指标水平相当,在免疫应答反应相当的情况下,较低剂量为最佳剂量,因此10μg/只为最佳剂量。