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蛋白质的磷酸化是最常见的蛋白质翻译后修饰之一,多数蛋白质的磷酸化发生在细胞内,由细胞内蛋白激酶催化完成;细胞外蛋白质酪蛋白的磷酸化也早在1883年就已发现,但使其磷酸化的蛋白激酶却直到130年后才被报道。此后VLK、c-Src酪氨酸激酶等多种分泌型蛋白激酶被陆续发现。我们研究发现,c GMP依赖性蛋白激酶Ⅱ(TypeⅡc GMP-dependent protein kinase,PKGⅡ)也是一种分泌型蛋白激酶。早期研究证明,PKGⅡ可以通过阻断血管内皮细胞生长因子受体(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor,VEGFR)等多种胃癌细胞受体酪氨酸激酶家族成员的激活来抑制由这些RTKs启动的信号转导和与之相关的胃癌细胞增殖、迁移等生物学活动,而分泌到细胞外的PKGⅡ对细胞的作用及作用靶点尚不明确。本文以重组蛋白GST-PKGⅡ直接作用于胃癌细胞,模拟分泌型PKGⅡ的作用模式,在转录组测序分析的基础上,结合实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测并验证重组PKGⅡ对胃癌细胞株AGS和HGC-27基因表达的影响,初步探索PKGⅡ在细胞外的作用及其可能的作用靶点。本研究的实验内容与方法:(1)通过转录组测序分析(RNA-Sequencing,RNA-Seq)大通量检测重组PKGⅡ对胃癌细胞株AGS基因表达的影响;(2)采用qRT-PCR检测重组PKGⅡ对胃癌细胞增殖相关基因转录水平的影响;(3)采用Western blotting检测重组PKGⅡ对胃癌细胞目的基因相关蛋白表达的影响;(4)采用Western blotting检测生长因子EGF和VEGF-A对胃癌细胞株AGS和HGC-27中EGF表达的影响;(5)采用Western blotting检测重组PKGⅡ对VEGF-A介导的AGS和HGC-27细胞ERK1/2磷酸化的影响;(6)提取AGS和HGC-27细胞中的核蛋白,采用Western blotting检测重组PKGⅡ对HIF-1α核转位的影响;研究结果:(1)RNA-Seq共筛选出579个差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),在重组PKGⅡ的作用下267个基因表达明显上调,312个显著下调,从中筛选出9个与增殖、凋亡相关的基因进行q RT-PCR验证。(2)在重组蛋白GST-PKGⅡ和8-p CPT-c GMP的共同作用下,EGF、DFNA5、DACT1、PSCA的m RNA水平改变在AGS和HGC-27两个细胞株中都表现出与RNA-Seq一致的趋势(均P<0.05),AGS中GLI1的m RNA变化趋势也与RNASeq结果一致。(3)Western blotting结果显示在GST-PKGⅡ和8-p CPT-c GMP的共同作用下,AGS和HGC-27两个细胞株中EGF蛋白质水平均下调,与RNA-Seq和q RT-PCR结果一致。(4)Western blotting结果显示,EGF和VEGF-A能够使AGS和HGC-27细胞中的EGF前体蛋白水平上调。(5)Western blotting结果显示,GST-PKGⅡ可抑制AGS和HGC-27中ERK1/2的磷酸化,在8-p CPT-c GMP的刺激下,该抑制作用更明显。(6)提取核蛋白,用Western blotting检测HIF-1α的核转位情况,结果显示无论有无8-p CPT-c GMP的刺激,在GST-PKGⅡ的作用下HIF-1α的核转位在两个细胞株中均可被有效抑制。研究结论:分泌型PKGⅡ可引起人胃癌AGS细胞株众多基因m RNA水平改变;且分泌型PKGⅡ可能通过抑制VEGF-A介导的MEK/ERK信号通路的激活,进而抑制HIF-1α核转位而降低其转录活性,最终抑制胃癌细胞EGF表达。