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随着对TLR样受体(Toll-like receptor)调节免疫细胞活化的研究逐步深入,TLRs配体作为免疫佐剂用于肿瘤免疫治疗中已取得了一定疗效。这些TLR配体可以单独使用,为进一步增强疫苗的免疫效果,也可将他们联合使用。但是,TLRs配体的联合使用对免疫细胞活性的调节作用可能为相互协同、亦可能为相互拮抗;同样的TLRs配体在不同的免疫细胞上可以产生不同的作用;即使在同一免疫细胞上。巨噬细胞在肿瘤的发生发展中具有重要的作用,不同极化类型的巨噬细胞对肿瘤的发展具有不同的作用,而研究TLRs配体联合应用在M2型巨噬细胞表型转化中的调控作用将为肿瘤免疫治疗提供新策略。本研究采用TLR2激动剂(Pam3CSK4)、TLR4激动剂(LPS)以及TLR7/8激动剂(R848)体外联合刺激小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠骨髓来源巨噬细胞及RAW264.7,通过Griess法检测巨噬细胞分泌NO含量、采用qPCR结合ELISA法检测M1/M2型巨噬细胞标记分子,从而分析三种TLRs激动剂联用后对于巨噬细胞活化及极化的影响。结果显示,与Pam3CSK4、LPS及R848单独处理组及两两结合组相比,三者联用后使NO、IL-1β、IL-6、TNF-α分泌水平显著增加,提示它们可协同活化巨噬细胞;同时,三者联合后的M1型巨噬细胞标志iNOS、IL-12表达显著上调,而M2型标志Arg-1、IL-10的表达水平显著下降,提示Pam3CSK4、LPS及R848联合可促进巨噬细胞向M1型极化。进一步,以Lewis肺癌细胞培养上清模拟肿瘤微环境诱导小鼠腹腔巨噬细胞构建M2型巨噬细胞模型。然后再加入Pam3CSK4、LPS及R848,通过分析M1/M2巨噬细胞表型标志,探讨三者联用对于M2型巨噬细胞翻转能力的影响。结果显示,Pam3CSK4、LPS及R848单独使用时不足以逆转M2型巨噬细胞向M1型极化,两种激动剂联用可一定程度翻转,而三者联用时诱导产生的M1型巨噬细胞炎症因子更高。以上结果提示Pam3CSK4、LPS及R848联用可调控M2型翻转向M1型。最后,我们以TRAF3及TRAF6的平衡为切入点,初步探讨了Pam3CSK4、LPS及R848联合诱导促进巨噬细胞M1极化的机制,采用qPCR法联合western blot检测了MyD88、TRIF、TRAF3及TRAF6的表达含量。结果表明,Pam3CSK4、LPS及R848联合后显著上调TRIF、TRAF6表达及p-IκB/IκB比例,部分上调MyD88,同时下调TRAF3表达。提示TRAF3和TRAF6的平衡可能在调控巨噬细胞极化方面具有重要作用。本研究不仅揭示Pam3CSK4、LPS及R848联用可直接诱导M1型巨噬细胞极化,更揭示三者联用可逆转M2型巨噬细胞向M1型极化,研究为基于TLRs激动剂联合应用开发的新型免疫增强剂提供理论依据,并可以此为依据为肿瘤治疗提供新策略。