论文部分内容阅读
背景:肾细胞癌是成人肾脏肿瘤中常见的疾病,大约占肾部肿瘤的90%,在成人癌症中大约占3%。其发病率、死亡率近些年呈现增加趋势。肾细胞癌是一种棘手的癌性疾病,很多患者通常伴随着肿瘤转移及治疗后复发。目前,针对肾细胞癌的发病分子机制还处于未知状态,且缺少有效的治疗手段。所以,针对肾细胞癌分子机制的研究和寻找特异性分子靶向治疗手段成为当前亟须解决的问题。miRNAs是一种没有编码的RNA,长度约为22个核苷酸组成,其可以直接靶向3’-UTR m RNA,直接引起m RNA的降解和抑制翻译过程,在细胞中扮演着调控基因表达的作用。之前很多研究已经证明了miRNAs是癌症发生和发展的主要调控因子,其功能通常为致癌基因或抑癌基因,调控着细胞的分化、侵袭、转移和凋亡。有研究报道在肾细胞癌中有很多的miRNAs功能紊乱,可能参与肾细胞癌的发生。因此,miRNAs是肾细胞癌的潜在诊断和预后判断的生物标记物,同时其也可以作为肾细胞癌的治疗靶点。但是miRNAs在肾细胞癌中扮演的角色以及相关分子作用机制尚不清楚,需要进一步的研究进行探讨。很多研究发现AEG-1在很多种癌症中是一种新型的致癌基因,可以被HIV-1和TNF-α激活。AEG-1在癌症、肥胖和神经退行性疾病中扮演着重要的角色,在很多癌症中存在着AEG-1高表达,如胃癌、肠癌、肝癌、胶质瘤和前列腺癌。后续研究发现AEG-1能激活很多促进瘤体形成的细胞信号通路。AEG-1能激活MAPK通路,特别是ERK通路,活化后的ERK通路交叉靶向作用于Wnt信号通路,而Wnt/β-catenin是多种肿瘤形成的重要通路。Wnt/β-catenin通路中的LEF-1与β-catenin形成二聚体而活化,Wnt与FZD结合,通过磷酸化灭活GSK3α/β,导致了β-catenin水平增加,引起核内基因的激活进行转录。AEG-1能负调控Wnt的负性调控子APC和CTBP2,同时发现LEF-1抑制后影响了Wnt对AEG-1调控,能降低细胞的侵袭能力。FZD7是Wnt/β-catenin信号通路的一个主要的共同受体。在很多癌症中都存在异常FZD7的表达和异常Wnt/β-catenin信号通路活化。FZD7通过Wnt/β-catenin信号通路调控癌症的分化、侵袭和转移。肾细胞癌与Wnt/β-catenin信号通路可能有密切的联系,在肾细胞癌组织和细胞株中FZD7有着异常高表达,可能与Wnt介导的肾细胞癌产生有关系。所以,我们认为在肾细胞癌的治疗中通过靶向Wnt信号通路是一种可能的治疗手段。有研究表明miRNAs与多种癌症的形成有关,但其在肾细胞癌中的作用目前还不清楚。所以,本研究以肾癌细胞系为研究对象,探讨miRNAs在肾细胞癌中的作用机制,确定miRNAs(miR-384、miR-613)是否通过靶向Wnt信号通路影响肾癌细胞的转归,进一步确定其是否可以作为一种潜在的新的靶向肾细胞癌治疗方法。方法:第一部分:肾细胞癌中miRNA-384靶向AEG-1的研究1.RT-q PCR法检测肾癌组织和肾癌细胞系中miR-384 m RNA的水平;在ACHN和Caki-1中给予miR-384模拟物和miR-384抑制剂后,RT-q PCR检测细胞中miR-384 m RNA的水平,检测肾癌细胞增殖、分化和侵袭能力。2.生物信息学分析miR-384是否靶向AEG1的3’-UTR,荧光素酶报告基因验证miR-384是否靶向AEG1 3’-UTR;RT-q PCR法检肾癌组织中AEG1 m RNA的水平。给予miR-384模拟物和miR-384抑制剂后,观察AEG-1对Wnt信号通路的影响。3.过表达AEG-1后,观察Wnt信号通路及细胞增殖率和侵袭力变化。第二部分:肾细胞癌中miRNA-613靶向FZD7的研究1.RT-q PCR法检测肾细胞癌细胞系中miR-613 m RNA的水平;在ACHN和786-O中加入miR-613模拟物,RT-q PCR检测miR-613 m RNA水平;给予miR-613模拟物后,MTT法检测ACHN和786-O的细胞增殖率;给予miR-613模拟物处理ACHN和786-O细胞后,Colony Formation Assay检测细胞分化能力;给予miR-613模拟物处理ACHN和786-O细胞后,Transwell Invasion Assay检测细胞的侵袭能力。2.生物信息学分析miR-613是否靶向FZD7的3’-UTR,荧光素酶报告基因验证miR-613是否靶向FZD7 3’-UTR;RT-q PCR和Western Blot法检测ACHN和786-O中的FZD7的水平。3.恢复FZD7的表达后,RT-q PCR和Western Blot检测ACHN和786-O中FZD7蛋白表达水平,检测细胞增殖率和侵袭力的逆转情况。第三部分:miR-384联合miR-613对肾细胞癌细胞ACHN的影响联合miR-384模拟物和miR-613模拟物,观察ACHN的增殖率;Transwell Invasion Assay法检测ACHN细胞侵袭能力;Western Bolt观察Wnt活性的改变。结果:第一部分:在肾细胞癌中miRNA-384靶向AEG-1的研究1.RT-q PCR结果显示:与癌旁肾组织相比,肾癌组织中miR-384的水平显著降低(P<0.01)。与肾微管上皮细胞株相比,在肾细胞癌细胞ACHN、A-498、786-O和Caki-1中,miR-384的水平显著降低(P<0.01)。在ACHN和Caki-1细胞中应用miR-384模拟物和miR-384抑制剂后,RT-q PCR结果显示:与miR NC组相比,miR-384模拟物组的miR-384水平显著增高(P<0.01)。miR-384抑制剂组的miR-384水平降低(P<0.05);CCK8结果显示:与miR NC组相比,miR-384模拟物组细胞增殖率降低(P<0.05)。miR-384抑制剂组细胞增殖率增高(P<0.05);细胞克隆实验和细胞侵袭实验结果显示:与miR NC组相比,miR-384模拟物组细胞数目降低(P<0.05)。miR-384抑制剂组细胞数目增高(P<0.05);2.生物信息学分析miR-384是否靶向AEG1的3’-UTR,荧光素酶报告基因结果证实野生型的AEG1 3’-UTR可以直接靶向miR-384,在野生型AEG1 3’-UTR的miR-384模拟物组的荧光强度降低(P<0.05),而miR-384抑制剂组中荧光强度增强(P<0.05)。RT-q PCR检测肾癌组织中AEG1 m RNA的表达水平,发现与癌旁组织相比,肾癌组织中AEG1 m RNA的水平显著增加(P<0.01)。RTq PCR和Western Blot结果显示:与miR NC组相比,miR-384模拟物组中AEG1的表达水平降低(P<0.05),而在miR-384抑制剂组中AEG1的表达水平增加(P<0.05)。荧光素酶报告基因结果显示:与miR NC组相比,miR-384模拟物组Wnt活性降低,而在miR-384抑制剂组中Wnt活性增高(P<0.05)。3.过表达AEG-1后,与miR-384模拟物组相比,miR-384 mimics+AEG-1组Wnt活性增加(P<0.05);CCK8结果显示:与miR-384模拟物组相比,miR-384mimics+AEG-1组细胞增殖率增加(P<0.05);细胞侵袭实验结果显示:与miR-384模拟物组相比,miR-384 mimics+AEG-1组细胞侵袭能力增加(P<0.05);第二部分:在肾细胞癌中miRNA-613靶向FZD7的研究1.RT-q PCR结果显示:与肾微管上皮细胞株相比,ACHN、786-O、A498、Caki-2中miR-613的水平降低(P<0.05);在ACHN和786-O细胞中给予miR-613模拟物,RT-q PCR结果显示:与Blank组和miR NC组相比,ACHN和786-O中miR-613模拟物组miR-613水平显著增加(P<0.01);在ACHN和786-O细胞中给与予miR-613模拟物后,结果显示:与Blank组和miR NC组相比,miR-613模拟物组细胞增殖率、分化和侵袭能力降低(P<0.05)2.生物信息学分析miR-613是否靶向FZD7的3’-UTR,荧光素酶报告基因结果证实miR-613可以直接靶向野生型的FZD7 3’-UTR,在野生型FZD7 3’-UTR的miR-613模拟物组的荧光强度降低(P<0.05)。在ACHN和786-O细胞中,RTq PCR和Western Blot结果显示:与Blank和miR NC组相比,miR-613模拟物组中FZD7的表达水平降低(P<0.05)。3.过表达FZD7后,在ACHN和786-O细胞中,MTT结果显示:与miR-613模拟物组相比,miR-613 mimics+FZD7组细胞增殖率增加(P<0.05);细胞侵袭实验结果显示:与miR-613模拟物组相比,miR-613 mimics+FZD7组细胞侵袭能力增加(P<0.05);第三部分:miR-384联合miR-613对肾细胞癌的Wnt通路的影响联合miR-384模拟物和miR-613模拟物处理ACHN细胞,CCK8结果显示:与miR-NC组相比,miR-384模拟物组和miR-613模拟物组的细胞增殖率降低(P<0.05)。与miR-384模拟物组和miR-613模拟物组相比,miR-384+miR-613模拟物组的细胞增殖率显著降低(P<0.01);Transwell Invasion Assasy结果表明:与NC组相比,miR-384 mimics组和miR-613 mimics组细胞侵袭能力显著降低(P<0.01)。与miR-384 mimics组和miR-613 mimics组相比,miR-384 mimics+miR-613 mimics组细胞侵袭能力降低(P<0.05)。Western Blot结果显示,与miR-NC组相比,miR-384模拟物组和miR-613模拟物组的Wnt蛋白表达降低(P<0.05)。与miR-384模拟物组和miR-613模拟物组相比,miR-384+miR-613模拟物组Wnt蛋白表达显著降低(P<0.01);结论:1.miR-384和miR-613在肾细胞癌中低表达,抑制肾细胞癌的增殖、分化和侵袭能力。2.肾细胞癌中miR-384靶向AEG1 3’-UTR功能区域,抑制AEG1表达。miR-613靶向FZD7的3’-UTR功能区域,抑制FZD7的表达。3.miR-384通过靶向AEG-1抑制Wnt信号通路。4.miR-384联合miR-613抑制肾细胞癌细胞的增殖和侵袭能力,与Wnt信号通路有关,需要进一步的实验进行验证。