无乳链球菌（Streptococcusagalactiae），又称B群链球菌(groupBstreptococcus，GBS)，可致新生儿脑膜炎和败血症，牛乳腺炎，鱼类的脑膜脑炎。其中，无乳链球菌引致的牛隐形乳腺炎对牛奶的产量和质量有重大影响。　　噬菌体能够裂解细菌。随着细菌耐药性的问题日益突出，作为一种可替代抗生素的抗菌制剂，噬菌体及其裂解酶等受到了广泛关注。另外，噬菌体在全球生物圈的生态平衡和细菌的演化中扮演了重要的角色。无乳链球菌的噬菌体研究起步较早，但发展缓慢，目前还没有无乳链球菌噬菌体全基因组序列的报道。　　分离了4株特异裂解牛源无乳链球菌的噬菌体，对其中两株噬菌体进行了生物学特性和比较基因组学分析，鉴定了其裂解酶的功能。同时，筛选了这2株噬菌体的溶原株，对溶原株的生物学特性进行了分析。　　1.无乳链球菌噬菌体的分离与鉴定　　采用两种分离方法分离无乳链球菌的噬菌体:从自然环境样品分离以及从溶原菌中诱导分离。两种方法共分离到了4株噬菌体，其中噬菌体LYGO9、JX01和HZ04分离于乳腺炎奶样中，pA11诱导自无乳链球菌HAJL2011070601。电镜观察4株噬菌体均具有长尾噬菌体科（Siphoviridae）成员的特点，头部呈正六边形，直径约50nm，尾部无伸缩性，长度约200nm。4株噬菌体均特异性裂解牛源无乳链球菌菌株。对42株牛源无乳链球菌分离株的裂解情况分别为，LYGO9裂解12/42(28.6％)、JX01裂解23/42(54.8％)、HZ04裂解20/42(47.6％)和pA11裂解13/42(31％)。EcoRⅠ、SalⅠ、XbaⅠ和PstⅠ酶切这4株噬菌体DNA呈现不同的酶切图谱。与30％甘油4℃保存和7％DMSO液氮中保存的方法相比，上述4株噬菌体于SM液中4℃保存的效果最好。　　2.无乳链球菌的噬菌体LYGO9和JX01的生物学特性　　为确定LYGO9和JX01宿主范围的特异性和差异性是否与噬菌体的吸附有关，测定了LYGO9和JX01吸附曲线，比较了二者对不同菌株的吸附谱。结果显示，这2株噬菌体于37℃与宿主菌TZ201102作用15min，均可90％以上吸附;二者的吸附谱并无明显差异，然而裂解谱却差异较大。受体阻断试验表明，多糖是可能的受体。此外，测定了LYGO9和JX01的一步生长曲线，结果显示，LYGO9的潜伏期仅5min，JX01的潜伏期达30min，二者的对数生长期分别为25min和20min，裂解量分别为30PFU/cell和20PFU/cell。这2株噬菌体与其相应的宿主菌的最适MOI均为0.01;对热敏感，60℃处理30min存活率＜1％;有一定的酸碱耐受性，尤其是JX01在pH(3-11)的条件下作用1h，其滴度仍能保持在同一数量级内。SDS-PAGE分析其结构蛋白，发现二者具有相似的6条结构蛋白条带，其中，32kD的条带丰度最高。　　3.无乳链球菌噬菌体LYGO9和JX01基因组测序及比较基因组学分析　　采用高通量测序的方法测定噬菌体LYGO9和JX01的基因组。二者的基因组呈模块化构成，包括复制、转录调控、DNA包装、裂解、形态和溶原几个基因模块。LYGO9基因组呈线状排列，为双股DNA分子，由41660个核苷酸组成，GC含量为36.73％。JX01也为线状双股DNA分子，由43028个核苷酸组成，GC含量为36.81％。LYGO9和JX01被分别预测有66和70个ORFs。二者具有一个相同的tRNA—tRNA(get)。比较基因组分析表明，LYGO9和JX01具有相同的DNA包装、宿主裂解和形态基因模块，而复制、调控及溶原相关的基因不同。与其他链球菌的前噬菌体基因组比较分析表明:二者与化脓链球菌MGAS9429和MGAS315的前噬菌体之间存在基因的水平转移;与化脓链球菌MGAS9429和MGAS315的前噬菌体之间的同源性高于无乳链球菌前噬菌体LambdaSa01和LambdaSa03。迄今为止，尚无无乳链球菌噬菌体的全基因组的报道，描述的LYGO9和JX01的基因组，是国内外首次报道。　　4.噬菌体LYGO9和JX01裂解酶基因的表达纯化及活性鉴定　　噬菌体LYGO9和JX01的裂解酶推测分别由orf16和orf44编码。生物信息学分析二者具有两个保守的结构域:肽链内切酶活性有关的CHAP结构域和与溶菌酶活性有关的GH25-Cpll-like的结构域。LYGO9和JX01的裂解酶基因的DNA和氨基酸同源性达98％以上，不同的氨基酸均位于CHAP结构域中。为验证orf16和orf44的功能，将LYGO9和JX01的裂解酶基因的全长和CHAP结构域分别插入至pET-32a(+)中构建重组表达载体，导入大肠杆菌BL21(DE3)中，用IPTG诱导表达，获得重组蛋白O91ysa、O91ys12a、011ysa和011ys12a。4个重组蛋白用镍柱纯化后进行酶活试验，均能在相应的位置形成透明的条带，表明LYGO9和JX01的裂解酶基因及CHAP结构域经体外重组表达后均具裂解宿主菌TZ201102细胞壁的生物学活性。　　5.无乳链球菌溶原菌株的筛选及特性分析　　无乳链球菌基因组中存在大量噬菌体相关的基因，这些基因大约占无乳链球菌所有菌特异性基因的10％左右。然而，这些噬菌体基因的功能很少研究，它们与无乳链球菌致病性的关系也不得而知。有鉴于此，筛选了无乳链球菌噬菌体LYGO9和JX01分别溶原感染TZ201102的溶原株O9RTZ201102和01RTZ201102;根据LYGO9和JX01具有不同溶原基因簇，筛选了LYGO9和JX01同时溶原感染TZ201102的溶原株O901RTZ201102;另外，筛选了JX01溶原感染另一株宿主菌CH201102的溶原株01RCH201102。测定溶原株和野生株的生长曲线，比较了各菌株形成生物被膜能力及对小鼠的致病性。结果表明，与野生株相比，溶原株O9RTZ201102和01RCH201102的生物被膜形成能力显著降低;各溶原菌株仅对其相应的噬菌体免疫，对其他同源性较高的噬菌体仍然易感;01RTZ201102对小鼠的毒力与野生株相比差异不大，其他溶原株的毒力均有减弱，其中O901RTZ201102感染小鼠的存活率达到62.5％，相应的野生株的存活率则为O。各溶原菌株与野生株一样，对青霉素敏感，对红霉素、四环素、克林霉素和环丙沙星耐药。