随着核技术在军事和民用领域的广泛应用,核辐射导致急性放射病(ARS)的概率越来越大,ARS尤其是极重度骨髓型ARS骨髓造血功能受到严重损伤,外周血白细胞(WBC)和血小板(PLT)缺乏,由此导致的感染和出血是ARS死亡的主要原因[1]。白介素12(IL-12)是一种以免疫调节作用著称的细胞因子[2],但其促进骨髓造血的作用研究较少,文献报道重组鼠白介素12(rmIL-12)可促进小鼠骨髓各系祖细胞的增值和分化,促进ARS小鼠造血功能的恢复[3、4],本实验旨在利用骨髓型ARS小鼠模型,观察rmIL-12对ARS小鼠造血功能的影响,为ARS治疗方案的制定提供实验依据。目的本实验利用亚致死照射剂量6.0Gy 60Coγ射线照射后建立的ARS小鼠模型,研究rmIL-12不同给药时间、不同给药剂量及与粒细胞集落刺激因子(G-CSF)联合应用对ARS小鼠造血功能的影响;比较rmIL-12与G-CSF在促进WBC恢复方面的作用,并与重组鼠促血小板生成素(rmTPO)比较在促进PLT恢复方面的作用。方法1. ARS小鼠动物模型的建立:给予6~8周BALB/C雄性小鼠6.0Gy 60Coγ射线一次全身照射,照射剂量率187cGy/min,照射距离80cm,通过观察照射后小鼠的临床表现、外周血常规、骨髓病理等方法鉴定ARS小鼠模型的建立情况。2. rmIL-12对ARS小鼠造血功能的影响:2.1 rmIL-12不同给药时间实验:6~8周雄性BALB/C小鼠分别采用①照射前24h、②照射后1h、③照射前24h+照射后1h等三种不同给药时间方案,腹腔注射(i.p.)rmIL12 5μg/kg,照射对照组给予等剂量溶剂,照后观察各组小鼠一般情况、外周血常规的变化;2.2 rmIL-12不同给药剂量实验:6~8周BALB/C雄性小鼠于6.0Gy 60Coγ射线照射前24h及照射后1h分别给予rmIL12 5、10、20、40、60μg/kg,i.p.,照射对照组给予等剂量溶剂,照后观察各组小鼠一般情况,外周血象值的变化;2.3 rmIL-12+G-CSF实验:rmIL-12+G-CSF治疗组BALB/C小鼠于照射前24h及照射后1h分别给予rmIL12 20μg/kg,i.p.,同时于照后2h即给予皮下注射(s.c.)G-CSF 100μg/kg·d×14天,G-CSF治疗组小鼠照后2h开始给予G-CSF 100μg/kg,s.c.×14天,rmIL-12治疗组小鼠于照射前24h及照射后1h给予rmIL-1220μg/kg,i.p.,照射对照组给予等剂量溶剂,照后观察各组小鼠一般情况,外周血常规的变化;2.4 rmIL-12与rmTPO比较实验,rmIL-12治疗组BALB/C小鼠于照射前24h及照射后1h给予rmIL12 20μg/kg,i.p.,rmTPO治疗组小鼠于照射后1h给予静脉注射(i.v.)rmTPO 300μg;照后观察各组小鼠一般情况、外周血常规的变化。2.5 rmIL-12 20μg/kg治疗组BALB/C小鼠与照射对照组小鼠骨髓病理及骨髓细胞集落培养生成单位的比较:分别于照射后第14天及第28天各组处死3只小鼠,留取股骨骨髓病理观察组织形态学改变,并无菌条件下留取2×105骨髓细胞行骨髓细胞集落培养,观察rmIL-12治疗后对ARS小鼠股骨病理组织形态学及形成集落生成单位(CFU)能力的影响。结果1. ARS小鼠模型建立: BALB/C雄性小鼠给予6.0Gy60Coγ射线一次全身照射后,小鼠精神差,活动量减少,外周血象值下降,照射后第1天WBC即下降至26.3%(照前值%,下同),第3天下降至7%,第11天下降至最低值(3%),第14天时开始恢复,但恢复速度较缓慢,照射后第21天始恢复至40%,第24天始恢复至68.9%;小鼠照射后血红蛋白(HGB)下降幅度较慢,照射后第7天时HGB始降至87.8%,第17天时降至最低值(49.9%),第21天时即开始恢复至72.3%,照射后第28天时已恢复至89.8%;小鼠照射后第1天PLT即下降至70.5%,第3天时53.1%,第7天时降至20.4%,照射后第14天降至最低值(8%),第17天PLT开始恢复,照射后第28天始恢复至60.4%;照后第14天小鼠股骨骨髓病理示骨髓腔呈空虚状态,仅见很少残留的造血细胞,几乎全被脂肪组织填充,照射后第28天骨髓病理提示造血功能逐渐恢复至正常。实验过程中小鼠无死亡,无腹泻、抽搐等表现,说明骨髓型ARS小鼠模型的建立是成功的。2. rmIL-12对ARS小鼠造血功能的影响2.1 rmIL-12不同给药时间实验中,rmIL-12治疗后ARS小鼠的一般情况得到改善,照射前给药、照射后给药组及照前照后联合给药组均促进小鼠PLT的恢复,照前给药及照前照后联合给药能够促进WBC的恢复,照后给药组WBC与照射对照组无统计学差异(P>0.05),各给药组小鼠HGB最低值均高于空白照射组(P<0.05),且恢复速度快于照射对照组;2.2 rmIL-12不同给药剂量实验中,rmIL-12促进PLT恢复的作用并未随着rmIL-12给药剂量的增加而增强,rmIL-12剂量在20μg/kg及40μg/kg时促进PLT恢复的作用较余剂量组明显,各剂量组较照射对照组均有统计学差异(P<0.05);照后+21天5、20、60μg/kg治疗组WBC较对照组有统计学差异(P<0.05),+24天时5、10、20、40、60μg/kg剂量组较照射对照组均有统计学差异;各剂量组HGB最低值较照射对照组均有统计学差异(P<0.05),但20、40μg/kg剂量组HGB在初始下降速度方面反而较照射对照组快(P<0.05);2.3 rmIL-12+G-CSF实验中,rmIL-12+G-CSF联合治疗组小鼠PLT恢复速度早期较单独G-CSF及rmIL-12 20μg/kg组明显,以照后+17天突出,后期较rmIL-12 20μg/kg组差,联合治疗组在促进WBC开始恢复时间方面与G-CSF组相当,快于单独rmIL-12 20μg/kg治疗组,后期较G-CSF及rmIL-12 20μg/kg组差,3个治疗组较照射对照组均有统计学差异(P<0.05);联合治疗组及G-CSF组HGB最低值高于照射对照组(P<0.05),且恢复速度上快于对照组,rmIL-12 20μg/kg治疗组HGB下降速度快于照射对照组,最低值与照射对照组无统计学差异,HGB恢复速度上慢于对照组;2.4 rmIL-12与rmTPO比较实验中,rmIL-12治疗组与rmTPO治疗组PLT最低值均高于照射对照组(P<0.05),两组间无统计学差异(P>0.05),PLT恢复过程中,rmIL-12治疗组在+21天、+24天、+28天PLT均高于rmTPO治疗组(P<0.05),rmIL-12与rmTPO两组较照射对照组均有统计学差异(P<0.05);2.5小鼠骨髓组织形态学变化提示rmIL-12治疗组小鼠造血功能优于照射对照组小鼠,骨髓细胞集落培养结果亦表明rmIL-12能促进小鼠骨髓细胞形成更多CFU-Mix。结论1.健康BALB/C雄性小鼠6.0Gy60Coγ射线一次全身照射后,成功建立了ARS小鼠模型,为进行ARS新药疗效试验、MSC及HSCT等治疗提供了理想的平台;2.不同给药时间点、不同给药剂量rmIL-12在促进ARS小鼠WBC、PLT恢复方面均有效,以PLT方面最明显,其促进PLT恢复的作用与公认的TPO疗效相当甚至更好,但其促进WBC恢复的作用不及目前应用广泛的G-CSF;不同剂量的rmIL-12在HGB恢复方面效果不定。与G-CSF协同应用并未促进WBC、HGB、PLT更好的恢复;3. rmIL-12治疗后ARS小鼠骨髓病理造血恢复明显优于照射对照组,并促进生成更多CFU-Mix;4.通过本实验,提示rmIL-12能够促进ARS小鼠造血系统的恢复,为IL-12应用于ARS的治疗提供了实验基础。