硫酸软骨素(CS)的基本结构是由葡萄糖醛酸和N-乙酷半乳糖肢组成的二糖单元交替连接构成的，是一种生物相容性较好的内源性粘多糖。硫酸软骨素以其独特的理化性质、生物可降解性和无毒性等特点被广泛用作药物的载体。此外，由于硫酸软骨素可以与肿瘤细胞表面过表达的CD44受体相结合，因此可以实现受体介导的靶向治疗。
　　ES2-AF肽是由抑制内皮细胞增殖迁移的ES2肽(IVRRADRAAVP)与阻断血管生成通路的Anti-Fltl肽(AF肽，GNQWFI)进行连接而得到的抗新生血管生成肽。由于体内多肽酶的存在使得多肽类药物存在稳定性差和半衰期短的缺点，因此通过化学修饰等于段对抗新生血管生成肽进行改造便成为了研究的热点。
　　顺铂(CDDP)是临床上常见的用来治疗癌症的化疗药物，可以与肿瘤细胞的DNA结合，使DNA的复制无法进行，从而诱导了细胞的凋亡。CDDP因其作用范围广、自身作用强以及可以与多种化疗药物协同作用等优点得到了广泛地使用，但是由于CDDP毒副作用强、无法主动靶向肿瘤部位以及在水中溶解度低等弊端限制了其进一步的应用。
　　肿瘤细胞因其代谢旺盛形成了不同于正常组织的的有利于自身生长发育的独特微环境，该环境具有低pH、低氧、还原性物质含量高等特性。因此针对肿瘤微环境中含有大量的还原性物质(谷胱甘肽，GSH)这一特征，本课题将含有二硫键的肮胶(Cys)作为连接臂来连接CS与ES2-AF肽，以期在响应于肿瘤微环境实现药物控制释放的同时，改善ES2-AF肽稳定性差和半衰期短的缺点，达到较好的靶向效果。此外，为了实现抗新生血管生成药物ES2-AF肽与化疗药物CDDP的协同治疗，CS与ES2-AF肽连接后对顺铀进行包载，以期达到"一药双靶"的效果，即药物靶向到达肿瘤部位后，由于独特的肿瘤微环境，二硫键断裂，纳米粒解体，释放顺铀与ES2-AF肽，从而在抑制内皮细胞增殖的同时杀伤肿瘤细胞，达到抑瘤的效果。本课题主要研究内容和结果如下:
　　(1)ES2-AF肽及结合物CS-Cys-ES2-AF的合成与表征
　　本课题以六个甘氨酸为linker连接了ES2和AF，得到抗新生血管生成多肽ES2-AF，经高效液相(HPLC)进行纯化确证，实验结果发现纯度均高于95％。然后以Cys为连接体，经过两步酷肢化反应，得到氧化还原敏感的结合物CS-Cys-ES2-AF。对核磁氢谱图分析后，CS-Cys-ES2-AF被成功制备，平均每条硫酸软骨素链上连接10个ES2-AF。
　　通过粒径及Zeta电位对CS-Cys-ES2-AF进行了物理表征，实验结果表明CS-Cys-ES2-AF的粒径为218.13±4.72nm,Zeta电位为-15.20±3.50mV。通过透射电镜观察CS-Cys-ES2-AF的形态，电镜图显示CS-Cys-ES2-AF在水中以球状的形态存在。
　　(2)ES2-AF及CS-Cys-ES2-AF体外活性评价
　　ES2-AF和CS-Cys-ES2-AF对内皮细胞增殖作用的影响是通过CCK8试剂盒来进行检测的。实验结果表明，随着ES2-AF及CS-Cys-ES2-AF浓度的不断增加，两者对内皮细胞增殖的抑制率也呈现上升趋势。当ES2-AF浓度分别为5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL时，对内皮细胞增殖的抑制率为(9.58％±1.48％)、(12.19％±2.01％)、(13.05％±1.74％)、(22.63％±1.62％)、(24.46％±3.31％)和(29.12％±4.66％)。经CS修饰后，抑制率分别为(11.76％±3.35％)、(15.59％±3.51％)、(18.20％±3.77％)、(24.07％±1.87％)、(27.21％±1.81％)和(38.21％±2.82％)。当ES2-AF浓度为500μg/mL时，CS-Cys-ES2-AF对内皮细胞增殖的抑制作用显著强于ES2-AF。
　　ES2-AF和CS-Cys-ES2-AF对内皮细胞的迁移作用是通过划痕法来进行评价的。实验结果表明，ES2-AF组和CS-Cys-ES2-AF组随着药物浓度的不断增加，对内皮细胞迁移的抑制作用呈现出浓度依赖性抑制。当ES2-AF浓度为100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL时，内皮细胞的迁移率为(53.90％±2.82％)、(42.02％±3.05％)和(34.37％±1.09％)。经CS修饰后，内皮细胞的迁移率为(35.73％±4.00％)、(27.28％±3.92％)和(25.70％±0.88％)。因此CS-Cys-ES2-AF对内皮细胞迁移的抑制作用显著强于未经修饰的多肽ES2-AF。
　　ES2-AF和CS-Cys-ES2-AF对内皮细胞形成管腔的影响是通过体外管腔形成实验来进行评价的。实验结果表明当ES2-AF浓度为100μg/mL、200μg/mL和?500μg/mL时，管腔形成的分支数为(152.00±26.09)、(143.00±4.84)和(119.11±9.51)。经CS修饰后，管腔形成的分支数为(110.11±8.50)、(103.89±8.01)和(90.00±7.00)。当ES2-AF浓度为200μg/mL和500μg/mL时，CS-Cys-ES2-AF对管腔形成的抑制显著优于ES2-AF。
　　(3)载顺铂的CS-Cys-ES2-AF的制备及表征
　　以CS-Cys-ES2-AF为载体材料，CDDP通过与CS链上羧基配位的方式进行包载，测得载药量(DL)为4.41％±0.36％，包封率(EE)为33.05％±0.95％。并对CDDP&CS-Cys-ES2-AF的粒径、Zeta电位以及粒径形态进行了物理表征，结果表明在水相中CDDP&CS-Cys-ES2-AF呈球状存在，粒径为231.07±15.51nm,Zeta电位为-14.13±1.34mV。
　　(4)CDDP&CS-Cys-ES2-AF的体外活性评价
　　通过CCK8试剂盒测定CDDP&CS-Cys-ES2-AF对内皮细胞以及黑色素瘤细胞增殖的影响。实验结果发现当浓度(以ES2-AF浓度计)为5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL时，CDDP&CS-Cys-ES2-AF对内皮细胞增殖的抑制率为(12.52％±2.75％)、(16.06％±1.58％)、(20.65％±3.20％)、(30.20％±3.31％)、(32.22％±0.96％)和(45.19％±2.97％),与不同浓度的CS-Cys-ES2-AF对内皮细胞增殖的抑制效果进行比较，发现当浓度(以ES2-AF浓度计)为200μg/mL和500μg/mL时，CDDP&CS-Cys-ES2-AF对内皮细胞增殖的抑制作用显著强于CS-Cys-ES2-AF。当浓度(以ES2-AF浓度计)为5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL时，CDDP&CS-Cys-ES2-AF对黑色素瘤细胞增殖的抑制率为(10.65％±2.31％)、(16.52％±1.10％)、(19.84％±1.44％)、(36.45％±3.67％)、(42.07％±3.38％)和(74.73％±2.42％)。以上实验结果表明，随着CDDP&CS-Cys-ES2-AF浓度的增加，药物对内皮细胞以及黑色素瘤细胞的增殖呈现出了浓度依赖性抑制。
　　通过划痕法评价了CDDP&CS-Cys-ES2-AF对内皮细胞以及黑色素瘤细胞迁移的影响。结果表明当浓度(以ES2-AF浓度计)为100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL时，内皮细胞的迁移率为(35.20％±0.53％)、(33.23％±1.26％)和(22.73％±4.16％)，与不同浓度的CS-Cys-ES2-AF对内皮细胞迁移作用的抑制效果进行比较，发现无显著性差异。当浓度(以ES2-AF浓度计)为100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL时，黑色素瘤细胞的迁移率为(34.02％±1.44％)、(19.18％±2.27％)和(15.47％±0.50％)。以上实验结果表明，CDDP&CS-Cys-ES2-AF对内皮细胞和黑色素瘤细胞的迁移呈浓度依赖性抑制。
　　通过体外管腔形成实验评价了CDDP&CS-Cys-ES2-AF抑制内皮细胞形成管腔的能力。结果表明当浓度(以ES2-AF浓度计)为100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL时，管腔形成的分支数为(113.00±1.73)、(95.67±7.64)和(89.00±3.61),CDDOP&CS-Cys-ES2-AF对内皮细胞的管腔形成呈浓度依赖性抑制。同时，与不同浓度的CS-Cys-ES2-AF对内皮细胞管腔形成作用的抑制效果进行比较，发现无显著性差异。
　　本课题成功制备了氧化还原敏感的CS-Cys-ES2-AF，同时制备了以CS-Cys-ES2-AF为载体对顺铀进行包载的结合物，通过一系列的体外活性实验，发现CS-Cys-ES2-AF和CDDP&CS-Cys-ES2-AF在体外均具有显著的活性以及较强的靶向性。同时，本研究也成功将抗新生血管生成药物与化疗药物应用在同一药物递送系统中，为抗肿瘤药物的开发奠定了基础。