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目的:卵巢癌（ovarian cancer,OC）是妇科三大恶性肿瘤之一,其死亡率位于妇科恶性肿瘤之首,其中以卵巢浆液性癌最常见,具有高发病率、高复发率、高死亡率的特点。紫杉醇联合铂类化疗方案是卵巢浆液性癌患者初次肿瘤细胞减灭术后的首选化疗方案。在过去的20年中,尽管卵巢癌完全缓解率已经达到80%以上,但大部分患者因反复复发而经历多次化疗,每次化疗后的无瘤生存期逐渐缩短,从化疗敏感变成化疗耐药,因此卵巢癌患者的5年生存率仍然低于40%,卵巢癌化疗的耐药问题一直是临床亟需解决的问题之一。众多研究发现肿瘤耐药与肿瘤的增殖、凋亡、迁移、侵袭、EMT等恶性生物学行为息息相关。因此深入开展对卵巢癌发生发展特别是耐药的分子机制研究,对于卵巢癌诊断、治疗及预后等有着重要作用。环状RNA（circular RNA,circ RNA）是一类具有特殊闭合环状结构的非编码RNA,不易被降解,且具有高度序列的保守性,因此其逐渐成为研究热点。目前大量研究发现,circ RNA参与肿瘤的增殖、转移、耐药等恶性生物学行为,在卵巢癌的发生发展中同样起到重要的调控作用,但在卵巢癌紫杉醇耐药中的研究尚未深入展开。因此前期通过卵巢癌耐药细胞系基因芯片筛选出差异表达的circ＿0000231。Circ＿0000231是由其本体基因ARHGAP12的第二、三外显子头尾连接而成。研究发现circ＿0000231可以通过ce RNA机制促进结肠癌、鼻咽癌动脉粥样硬化的发生发展以及调节阿霉素对心脏的毒性作用。截止目前,circ＿0000231在卵巢癌中的研究尚未有报道,因此开展circ＿0000231在卵巢癌中的研究以期找到新的诊断或治疗靶点。通过生物信息学分析预测circ＿0000231可能与mi R-140相结合。mi R-140位于16号染色体,研究发现mi R-140能够抑制卵巢癌的增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）,促进细胞凋亡等恶性生物学行为,但mi R-140对卵巢癌紫杉醇耐药的研究尚未开展。生物信息数据库预测RAS癌基因家族成员（member of RAS oncogene family,RAP1B）为mi R-140的靶基因。RAP1B是RAS小G蛋白家族的成员,RAS家族被广泛认知为癌基因,RAP1B在多种肿瘤中同样呈现促癌作用。同样RAP1B对卵巢癌紫杉醇耐药的研究尚无人报道。同时目前尚无mi R-140与RAP1B相结合的相关研究的报道。因此本研究希望通过体内外实验探索circ＿0000231通过mi R-140/RAP1B轴对卵巢癌增殖、凋亡、迁移、侵袭及EMT的恶性生物学行为及紫杉醇耐药的影响,并探索三者之间的作用机制,为卵巢癌紫杉醇耐药的基础研究提供新的理论依据。同时通过相关研究寻找逆转卵巢癌紫杉醇耐药的新靶点,为临床针对卵巢癌的治疗提供科学有力的参考。研究方法:1.本研究采用基因芯片技术,以人卵巢浆液性癌细胞系SKOV3及人卵巢浆液性癌紫杉醇耐药细胞系SKOV3-TR30为样本,筛选出差异表达的circ RNAs。通过q RT-PCR方法检测circ＿0000231在卵巢浆液性癌化疗耐药与敏感组织和细胞系中的表达水平,并分析了circ＿0000231的表达水平与卵巢浆液性癌临床病理生物学特征的关系。通过RNase R消化实验验证circ＿0000231的稳定性,荧光原位杂交检测circ＿0000231的细胞定位。构建circ＿0000231沉默表达及过表达的卵巢癌细胞系,并通过q RT-PCR检测转染效率。CCK-8实验检测circ＿0000231对卵巢癌细胞的增殖能力及紫杉醇药物敏感性的影响,流式细胞术、Transwell实验检测对卵巢癌细胞凋亡、迁移、侵袭能力的影响。同时,Western Blot检测circ＿0000231的沉默和过表达引起EMT标志蛋白（E-cadherin、Vimentin、MMP9）,耐药相关蛋白（β-tubulin III）的表达变化。构建稳转的敲减circ＿0000231细胞系,通过裸鼠移植瘤实验验证circ＿0000231在体内对卵巢癌增殖及耐药的影响。2.根据生物信息学分析预测与circ＿0000231相结合的mi RNAs（mi R-558,mi R-622,mi R-140,mi R-135b-5p）,q RT-PCR检测mi RNAs在沉默circ＿0000231中表达情况。进一步q RT-PCR检测circ＿0000231在干扰mi R-140前后的表达变化。双荧光素酶实验和RIP实验检测circ＿0000231与mi R-140是否能直接结合。荧光原位杂交检测circ＿0000231与mi R-140的细胞共定位。q RT-PCR检测mi R-140在卵巢浆液性癌化疗耐药及敏感组织和细胞系的表达情况。Spearman相关系数评估circ＿0000231的表达与mi R-140之间的相关性。构建上调及下调mi R-140细胞系,通过CCK-8、流式细胞术、Transwell等实验检测细胞增殖、紫杉醇药物敏感性、凋亡、迁移、侵袭等能力的影响。Western Blot检测各转染分组对EMT标志蛋白及耐药相关蛋白的表达变化。生物信息学分析预测mi R-140可能结合的下游靶基因RAP1B。双荧光素酶实验检测mi R-140与RAP1B是否能结合。进一步q RT-PCR和Western Blot检测在分别干扰circ＿0000231和mi R-140后RAP1B的表达变化。q RT-PCR及Western Blot检测RAP1B在卵巢浆液性癌化疗耐药及敏感组织和细胞系的表达情况。Spearman相关系数评估mi R-140的表达与RAP1B之间的相关性。构建过表达RAP1B细胞系,q RT-PCR检测转染效率,通过CCK-8实验检测对细胞增殖及紫杉醇药物敏感性的影响。3.构建沉默circ＿0000231下调mi R-140及沉默circ＿0000231过表达RAP1B细胞系,通过CCK-8、流式细胞术、Transwell等实验检测细胞增殖、紫杉醇药物敏感性、凋亡、迁移、侵袭等能力的影响。Western Blot检测各转染分组对EMT及紫杉醇耐药相关蛋白和RAP1B的表达变化。结果:1.circ＿0000231在卵巢浆液性癌紫杉醇耐药细胞系SKOV3-TR30中表达水平高于卵巢浆液性癌细胞系SKOV3,在卵巢癌化疗耐药组织中高表达于敏感组织,且与FIGO分期密切相关,与年龄、分化程度及淋巴结转移无关。circ＿0000231不能被RNase R酶所降解,同时FISH实验证实其定位于细胞质中。沉默circ＿0000231通过CCK-8实验发现其能抑制细胞增殖,增加卵巢细胞对紫杉醇的药物敏感性,过表达则相反。流式细胞术实验发现沉默circ＿0000231使细胞凋亡率增加,过表达则降低了细胞凋亡率。Transwell实验发现沉默circ＿0000231使细胞穿膜数减少,过表达则增加了细胞穿膜数。Western Blot实验发现沉默circ＿0000231使E-cadherin表达增高,Vimentin、MMP9及β-tubulin III表达降低,而过表达则相反。裸鼠成瘤实验结果发现沉默circ＿0000231抑制肿瘤的生长。免疫组化结果发现在裸鼠移植瘤组织中沉默circ＿0000231使β-tubulin III表达降低。差异均具有统计学意义。2.通过生物信息学预测了可能与circ＿0000231结合的mi RNAs（mi R-558,mi R-622,mi R-140,mi R-135b-5p）,q RT-PCR检测发现mi R-140在沉默circ＿0000231组中表达量最高。双荧光素酶实验及RIP实验证实circ＿0000231与mi R-140可以直接结合。FISH共定位提示circ＿0000231及mi R-140共定位于细胞质。q RT-PCR检测mi R-140在卵巢浆液性癌细胞系的表达高于卵巢癌浆液性癌紫杉醇耐药细胞系,在组织水平上,mi R-140在卵巢癌敏感组织中的表达高于耐药组织,且与circ＿0000231的表达呈负相关。CCK-8检测结果显示,下调mi R-140可以促进卵巢癌的细胞增殖的能力及对紫杉醇的耐药,相反上调mi R-140则起到抑制作用。流式细胞术实验发现下调mi R-140使细胞凋亡率降低,上调则提高了细胞凋亡率。Transwell实验发现下调mi R-140使细胞穿膜数增加,过表达则减少了细胞穿膜数。Western Blot实验发现下调mi R-140使E-cadherin表达降低,Vimentin、MMP9及β-tubulin III表达增高,而过表达则相反,差异均具有统计学意义。通过生物信息学预测了RAP1B可能与mi R-140结合。双荧光素酶实验证实两者可结合。q RT-PCR和Western Blot检测发现RAP1B的表达水平与circ＿0000231的表达变化趋势相同,与mi R-140的变化呈相反趋势。q RT-PCR及Western Blot检测RAP1B在SKOV3-TR30的表达水平明显高于SKOV3,在卵巢浆液性癌化疗耐药组织中亦呈高表达。Spearman相关系数评估mi R-140与RAP1B的表达水平呈负相关通过CCK-8实验检测我们发现过表达RAP1B后,能够促进卵巢癌细胞的增殖及对紫杉醇的耐药,差异均具有统计学意义。3.我们在SKOV3-TR30中构建了两组共转细胞系,分别是沉默circ＿0000231和下调mi R-140,沉默circ＿0000231和过表达RAP1B。在沉默circ＿0000231和下调mi R-140细胞系中,CCK-8实验检测结果显示anti-mi R-140可以逆转沉默circ＿0000231对卵巢癌细胞增殖及紫杉醇耐药的抑制作用。流式细胞术结果显示与沉默circ＿0000231组相比,加入anti-mi R-140共转染组凋亡率下降。Transwell实验检测细胞迁移和侵袭,结果显示与沉默circ＿0000231组相比,加入anti-mi R-140组细胞穿膜数目增加。Western Blot结果显示,与沉默circ＿0000231组相比,加入anti-mi R-140共转染组E-cadherin表达增高,Vimentin、MMP9、β-tubulin III及RAP1B表达降低,差异均具有统计学意义。在沉默circ＿0000231和过表达RAP1B细胞系中,CCK-8实验检测沉默circ＿0000231与过表达RAP1B共转染对卵巢癌细胞增殖能力的影响。结果显示,过表达RAP1B可逆转沉默circ＿0000231对卵巢癌细胞增殖和紫杉醇耐药的抑制作用。流式细胞术检测结果显示与沉默circ＿0000231组相比,加入过表达RAP1B共转染组凋亡率下降。Transwell实验检测细胞迁移和侵袭,结果显示与沉默circ＿0000231组相比,加入过表达RAP1B共转染组细胞穿膜数目增加。Western Blot结果显示,与沉默circ＿0000231组相比,加入过表达RAP1B共转染组E-cadherin表达增高,Vimentin、MMP9、β-tubulin III及RAP1B表达降低,差异均具有统计学意义。结论:1.circ＿0000231在卵巢浆液性癌化疗耐药组织及细胞系中高表达于敏感组织及细胞系,且与卵巢浆液性癌临床病理生物学特征中FIGO分期相关,与年龄、组织分化程度及淋巴结转移无关。2.circ＿0000231促进了卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭,抑制了细胞凋亡,促进了卵巢癌对紫杉醇的耐药。3.本研究证实了circ＿0000231通过结合mi R-140靶向调控RAP1B,通过ce RNA机制促进了对卵巢浆癌的恶性生物学行为及紫杉醇耐药的影响。