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黑糯米酒(Black glutinous rice wine)是一种传统的中国米酒,以黑糯米为原料加入酒曲和酵母酿造而成,在黄酒中别具一格。黑糯米酒是在开放的环境下多菌种参与进行的双边发酵。研究黑糯米酒发酵过程中风味形成与微生物潜在的关系,揭示有助于风味物质形成的主要功能微生物,对指导黑糯米酒生产和控制产品质量有重要意义。目前关于黑糯米酒的风味物质变化已有较多研究,但缺乏黑糯米酒发酵过程中的微生物群落组成和结构变化以及微生物与风味物质形成的关联研究。本论文主要研究了黑糯米酒发酵过程中风味物质和微生物群落的动态变化以及它们之间的潜在相关,揭示与风味物质形成相关的功能微生物,研究结果如下:(1)采用化学方法和高通量测序技术对贵州3种特色酒曲进行理化特性和微生物区系分析。理化特性分析表明,酒曲A中水分含量最高,酒曲B中酸度和液化酶活力最高,酒曲C中糖化酶活力最高;三种酒曲中细菌和真菌的多样性分析表明,酒曲A中物种丰富度最高,酒曲C中群落结构最复杂;在门水平上,酒曲A的优势细菌门为变形菌门,优势真菌门为接合菌门;酒曲B的优势细菌门为厚壁菌门,优势真菌门为接合菌门;酒曲C的优势细菌门为变形菌门,优势真菌门为子囊菌门。在属水平上,酒曲A优势细菌是红球菌属,酒曲B和酒曲C的优势细菌属均为芽孢杆菌属;酒曲A和酒曲B的优势真菌属为米根霉属,而酒曲C的优势真菌属为酵母属。CCA分析显示酒曲理化指标与酒曲细菌种群结构具有一定相关性。综合理化指标和微生物群落结构多样性分析确定选用酒曲C做为黑糯米酒酿造曲,进行接下来的研究。(2)采用高通量测序技术对黑糯米酒发酵过程中的微生物群落演替进行分析,结果表明:细菌共获得1,671,743对原始序列数;真菌共获得1,679,460对原始序列数;α-多样性分析表明细菌和真菌的微生物群落多样性和丰度指数均呈不稳定变化;β-多样性分析显示发酵过程中细菌群落演替分为5个阶段,而真菌群落演替分为3个阶段;分类学分析显示,细菌群落结构中共鉴定出5个细菌门和23个细菌属,其中厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)是主要的细菌门;明串珠菌(Leuconostoc),片球菌(Pediococcus),芽孢杆菌(Bacillus),乳杆菌(Lactobacillus)是主要的细菌属;真菌群落结构中共鉴定出3个真菌门和10个真菌属,其中毛霉菌门(Mucoromycota)和子囊菌门(Ascomycota)是主要的真菌门,而根霉菌(Rhizopus),酵母属(Saccharomyce),覆膜孢酵母(Saccharomycopsis)是主要的真菌属。(3)跟踪检测黑糯米酒发酵过程中理化指标的动态变化,结果表明:氨基酸态氮,酒精度和总酸呈总体上升趋势,p H呈先下降后上升趋势,而总糖含量在4天后急剧下降并保持相对稳定。采用顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用(HS-SPME-GC-MS)技术和高效液相色谱(HPLC)对黑糯米酒发酵过程中的挥发性风味物质和有机酸进行检测分析,结果表明:共检出44种挥发性风味物质,包括酯类17种,醇类7种,烷烃类7种,酸类4种,醛类3种,其他化合物6种。主成分分析(PCA)发现23种挥发性化合物对黑糯米酒整体风味及口感影响较大。有机酸共检测出9种,分别是草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、酮戊二酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸和乙酸,其中乳酸和琥珀酸是黑糯米酒中的主要有机酸。(4)采用气相色谱-飞行时间质谱(GC-TOF-MS)技术对发酵过程中的酒样进行代谢组学研究。结果表明:发酵过程中共鉴定出159种代谢物。基于PCA分析发现发酵2 d与4-24 d之间的代谢物含量差异显著(p<0.01),说明代谢物在发酵2d时(糖化阶段)变化最大。正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)鉴定出40种代谢物为不同发酵阶段之间的差异代谢物。通路分析表明差异代谢物共涉及28条途径,其中乳糖代谢,丙酮酸代谢,淀粉和蔗糖代谢,丙氨酸代谢,天冬氨酸和谷氨酸代谢,三羧酸循环,乙醛酸和二羧酸代谢以及氨基糖和核苷酸糖代谢为关键代谢途径。(5)通过关联分析对微生物菌群之间的共性关系进行分析表明:细菌相关性分析显示在细菌属之间共有51个正相关和4个负相关;真菌相关性分析显示在真菌属之间共有23个正相关和22个负相关;微生物与理化指标之间的相关性分析显示,细菌群落中Lactococcus和Pediococcus受总酸,p H,酒精度和氨基酸态氮的影响;真菌群落中Aspergillus受总酸,酒精度,p H值和氨基酸氮的影响,而Rhizopus与总糖含量变化相关;微生物属与挥发性化合物之间的相关性分析显示,共有13个微生物属对挥发性风味有重要影响(VIP>1.0,p<0.05),分别是Leuconostoc,Bacillus,Lactobacillus,克洛诺菌(Cronobacter),片球菌(Pantoea),Kosakonia,魏斯氏菌(Weissella),肠球菌(Enterococcus),Rhizopus,Saccharomycopsis,毁丝霉(Myceliophthora),Cystofilobasidium和曲霉菌(Aspergillus),其中Cronobacter,Pantoea和Weissella是主要核心功能菌;微生物与差异代谢物之间的相关性分析共发现71个正相关和37个负相关,共有5个细菌属对非挥发性代谢物影响较大,分别是Cronobacter,Pantoea,Weissella,Klebsiella,不动杆菌(Acinetobacter)。