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目的本课题围绕哮喘过程中ASMC的病理变化,根据“驱邪利肺”、“标本兼治”等中医治法理论,以名医经验方“过敏煎”中君臣配伍“防风-乌梅”药对作为干预手段,结合该领域研究进展,对干预前后ASMC相关指标进行对比,探索辛散酸收配伍抑制气道平滑肌增厚的作用机制,揭示“过敏煎”配伍的科学内涵,以探索哮喘更有效、更具有针对性的中医药临床治疗方案。方法第一部分:“防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠ASMC病理变化的影响及其机制研究。1、造模:将70只BALB/C小鼠随机分为正常对照组、哮喘模型组、激素干预组、防风组、乌梅组“防风-乌梅”组、“防风-乌梅”合激素干预组,每组10只。以复合型OVA建立哮喘模型,模型建立后,取小鼠肺组织进行相应处理,分别采用光学显微镜和透视电镜观察肺组织病理变化。2、“防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠肺组织结构的影响:按上述方法造模成功后连续按组别用药干预7天。防风组、乌梅组、“防风-乌梅”组、“防风-乌梅”合激素干预组分别于上午9时给予防风、乌梅、“防风-乌梅”、“防风-乌梅”药液灌胃,其余各组给予生理盐水灌胃;激素干预组、“防风-乌梅”合激素干预组同时分别于下午3时给予0.02%布地奈德雾化吸入,其余各组给予生理盐水雾化吸入。取材后,进行相应处理,光学显微镜下观察“防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠肺组织病理学的影响以及小鼠支气管平滑肌厚度的影响;透视电镜下观察“防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠肺组织超微结构的影响。3、“防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠肺组织气道重塑相关因子的影响:小鼠肺组织取材后匀浆,取上清液保存,采用ELISA法测定肺组织MMP-9、TIMP-1及炎症因子IL-6、IL-8、VEGF、TGF-β1、TNF-α的含量。4、“防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠肺组织ASMC周期及表型转化的影响:小鼠肺组织取材进行相应处理后,采用免疫组织化学染色方法,观察细胞周期调控蛋白(细胞周期蛋白CyclinD1与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P27kip1),凋亡蛋白(bcl-2、caspase-3)表达和分布;采用实时荧光定量PCR、Western-blot法检测平滑肌中细胞周期调控蛋白(CyclinD1、P27kip1)凋亡蛋白(bcl-2、caspase-3)mRNA、蛋白表达;分别采用实时荧光定量PCR、Western-blot法检测ASMC收缩型标志蛋白α-actin、合成型标志蛋白OPN在平滑肌中含量,判定表型转化情况。第二部分:“防风-乌梅”含药血清对PDGF诱导HBSMC增殖模型的影响及其机制研究。1、“防风-乌梅”配伍含药血清对HBSMC迁徙的影响:通过PDGF诱导的方式诱导HBSMC增殖模型;分别予大鼠灌胃防风、乌梅、“防风-乌梅”及生理盐水,制备含药血清;HBSMC增殖模型建立好后,取4代对数生长期的HBSMC,将其分为空白对照组、细胞模型组、正常大鼠血清组、正常大鼠血清细胞模型组、激素干预组、防风血清组、乌梅血清组、“防风-乌梅”血清组、“防风-乌梅”血清和激素干预组对细胞给予相应处理;采用平板迁移实验和跨膜迁移实验观察HBSMC的迁移能力。2、“防风-乌梅”配伍含药血清对HBSMC相关细胞因子的影响:ELISA法检测TNF-α、IL-8、MMP-9、TIMP-1的浓度及MMP-9/TIMP-1比值。结果第一部分:“防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠ASMC病理变化的影响及其机制研究。1、造模:正常对照组肺组织结构未见异常;哮喘模型组支气管上皮结构被破坏,气道内见大量脱落上皮细胞,杯状细胞增生明显,粘膜下及气道周围炎性细胞(淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及巨噬细胞)浸润,气道壁及支气管平滑肌明显增厚;哮喘模型组肺泡II型上皮细胞线粒体结构不清晰,见明显肿胀,板层小体结构紊乱、线粒体空泡化严重,可见嗜酸性粒细胞颗粒。2、“防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠肺组织结构的影响:与模型组相比,各药物组上皮结构均有改善,气道内可见少许脱落的上皮细胞,杯状细胞增生减轻,粘膜下及气道周围炎性细胞浸润缓解,气道壁及支气管平滑肌增厚减轻,以“防风-乌梅”组和“防风-乌梅”合激素干预组改善最明显;透视电镜下,药物治疗后哮喘模型组肺泡II型上皮细胞线粒体结构不清晰、肿胀、板层小体结构紊乱、严重线粒体空泡化等情况均得到明显改善,且“防风-乌梅”联合用药优于单独使用防风和乌梅,同时“防风-乌梅”合激素干预组有巨噬细胞出现,表明受损肺脏出现明显的修复迹象。3、“防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠肺组织气道重塑相关因子的影响:“防风-乌梅”配伍可降低肺组织IL-6、IL-8、MMP-9、TIMP-1的表达及MMP-9/TIMP-1的比值(P<0.05或P<0.01),以“防风-乌梅”合激素干预组最佳,“防风-乌梅”组优于防风组和乌梅组。相关性分析提示IL-6、IL-8与MMP-9、TIMP-1显著相关。4、“防风-乌梅”配伍对哮喘模型小鼠肺组织ASMC周期及表型转化的影响:综合各检测方法,结果显示“防风-乌梅”配伍可降低CyclinD1、bcl-2 mRNA及蛋白表达(P<0.05),升高P27kip1、caspase-3 mRNA及蛋白表达(P<0.05);“防风-乌梅”配伍能降低α-actin、OPN表达。第二部分:“防风-乌梅”含药血清对PDGF诱导人支气管平滑肌细胞HBSMC增殖模型的影响及其机制研究。1、“防风-乌梅”配伍含药血清对HBSMC迁徙的影响:平板迁移实验和跨膜迁移结果表明,“防风-乌梅”血清合激素干预组降低细胞迁移的能力要优于其余各给药组,“防风-乌梅”血清组降低HBSMC的迁移能力优于单独的防风血清组和乌梅血清组。2、“防风-乌梅”配伍含药血清对HBSMC增殖相关细胞因子的影响:ELISA法结果显示:“防风-乌梅”血清合激素干预组降低TNF-α、IL-8表达,抑制MMP-9/TIMP-1比值的能力要优于其余各给药组,“防风-乌梅”血清组降低TNF-α、IL-8表达,抑制MMP-9/TIMP-1比值的能力要优于单独使用防风血清组和乌梅血清组。结论1、“防风-乌梅”“相制为用”配伍可改善哮喘气道重塑,其机制可能与减轻支气管平滑肌肥厚、改善气道炎症、降低肺组织MMP-9、TIMP-1的表达及MMP-9/TIMP-1的比值,降低CyclinD1、bcl-2 mRNA及蛋白表达,升高P27kip1、Caspase-3 mRNA及蛋白表达,从而调节细胞增殖/凋亡失衡有关。2、“防风-乌梅”配伍能显著抑制HBSMC迁移与表型转换,阻滞细胞周期进程,影响气道重塑,其机制可能通过抑制TNF-α、IL-8释放,抑制MMP-9/TIMP-1比值有关。“防风-乌梅”作为“过敏煎”的君臣药对,其通过对哮喘发作过程中的ASMC增殖/凋亡平衡进行干预,减轻气道炎症,从而减缓气道平滑肌增厚,发挥其“相制为用”的作用。