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摘要：目的 从血脑屏障的角度探讨三七总皂苷对铝暴露脑微血管内皮细胞胞质紧密黏连蛋白1（zonula occludens-1， ZO-1）表达的影响，初步揭示三七总皂苷抗老年痴呆的可能靶点及机制。方法 采用脑微血管内皮细胞系Balb/c，以含20%胎牛血清和100 mg/L生长因子的DMEM培养基培养，随机分为正常组、模型组、铝螯合剂组及三七总皂苷低、中、高剂量组，经铝暴露24 h后，分别以荧光实时定量PCR和Western blot的方法测定ZO-1的基因转录和蛋白表达水平，观察不同剂量三七总皂苷对ZO-1表达的影响。结果 与正常组相比，铝暴露24 h可使脑微血管内皮细胞ZO-1的转录及表达明显减少（P<0.01）。与模型组比较，三七总皂苷高剂量组能显著增加ZO-1的基因转录水平（P<0.05），中、高剂量组能显著提高ZO-1的蛋白表达（P<0.05，P<0.01）。结论 三七总皂苷对铝暴露下的脑微血管内皮细胞具有一定的保护作用，可增加血脑屏障紧密连接主要组成蛋白ZO-1的表达。
关键词：老年痴呆；铝暴露；三七总皂苷；胞质紧密黏连蛋白1
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）09-0036-04
虽然老年痴呆（Alzheimer’s disease，AD）发病的确切病因尚未明确，但可以肯定的是AD是一多种因素引发的进行性神经退行性疾病[1]。在众多因素中，铝离子暴露一直是人们关注最多的致病因素之一[2]。AD的标志性病理特征是脑内淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）形成的淀粉样斑块，铝可以通过改变Aβ的构象，并抑制降解Aβ的酶，从而促进Aβ的脑内沉积，导致神经元凋亡[3]。因此，采用铝暴露可以成功模拟出与AD病理改变类似的动物模型[4]。目前，大多数研究集中于揭示铝在脑内与Aβ共同作用或协助Aβ沉积产生神经毒性的机制，而铝对脑微血管内皮细胞作用的研究涉及很少。脑微血管内皮细胞是血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）结构及功能的基础，而血循环中铝最先遇到的是BBB，铝跨越BBB及对BBB的影响是铝引发脑内一系列病理生理改变的核心[5]。中药三七具有散瘀止血、消肿定痛之功效，被广泛应用于脑血管疾病的临床治疗中，其主要药效成分三七总皂苷对AD模型动物有良好的治疗作用[6]。本研究通过观察铝暴露下脑微血管内皮细胞中胞质紧密黏连蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）的变化，初步探讨铝对BBB的可能影响，从另一角度揭示三七总皂苷治疗AD的可能机制及靶点。
1 实验材料
1.1 细胞
小鼠脑微血管内皮细胞系Balb/c（中日友好医院娄晋宁教授惠赠，经抗Ⅷ因子抗体、抗CD31抗体及DiI-乙酰化低密度脂蛋白标记摄取检测，符合内皮细胞特性[7]）。
1.2 主要药物及试剂
注射用血塞通（冻干），400 mg/支，昆明制药集团股份有限公司，批号09HA05；三氯化铝（AlCl3）纯度≥99.0%，分子量133.34，Sigma公司，批号139757554408171）；铝螯合剂（1，2-二甲基-3-羟基-4-吡啶酮，DHPO；分子量139.15，Sigma公司，批号STBD1101）；胎牛血清（Invitrogen公司）；内皮细胞生长因子（由中日友好医院临床研究所病理生理室提取）；总RNA纯化系统试剂盒、反转录系统试剂盒（Promega公司）；Power Sybr Green PCR Master Mix（ABI公司）；PVDF膜（Millipore公司）；RIPA裂解液（普利莱基因公司）；ECL发光液（上海碧云天生物技术有限公司）；蛋白质Marker（Fermentas 公司）；Cocktail蛋白酶抑制剂、PhosSTOP磷酸酶抑制剂（Roche 公司）；BCA蛋白定量测定试剂盒（北京赛驰生物科技有限公司公司）。
1.3 主要仪器
Mx3000p定量PCR仪（ZA29-Mx3000P，Stratagene公司）；倒置相差显微镜（Olympus IMT-2）；高速冷冻离心机（HC-3018R，科大创新）；CO2培养箱（MCO-20AIC，SANYO公司），可见光紫外分光光度计（Multispec1501，岛津公司）；Genegenome凝胶成像系统（Syngene公司）；BioRad Mini-4垂直电泳槽和转膜仪（Biorad公司）；Genegenome凝胶成像系统（Syngene公司）。
2 实验方法
2.1 脑微血管内皮细胞的复苏、培养和传代
从液氮中取出细胞冻存管，37 ℃水浴箱迅速融化，传至已用明胶包被的75 cm2的培养瓶中，放入适量的内皮细胞培养基（DMEM培养基中添加20%胎牛血清、谷氨酰胺2 mmol/L、青霉素100 000 U/L、链霉素100 mg/L、肝素40 000 U/L、内皮细胞生长因子100 mg/L），37 ℃、5%CO2培养箱培养，1～2 d换液，3～4 d传代1次，用胰酶消化细胞。实验采用第24代细胞。
2.2 分组
将单细胞悬液接种于60 mm培养皿中，每皿5×105 mL个细胞，加培养基4 mL，置CO2培养箱中孵育，待细胞90%以上融合时随机分为正常对照组（DMEM培养基）、模型组（DMEM培养基中含AlCl3 125 ?g/mL）、阳性对照组（DMEM 培养基中含铝螯合剂30 ?g/mL）及三七总皂苷低、中、高剂量组（DMEM 培养基中分别含三七总皂苷25、50、100 ?g/mL）。每组设6个复孔，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。
2.3 荧光实时定量PCR反应
2.3.1 总RNA提取 各组培养24 h后弃液，将消化的单细胞混悬液收集于EP管中，采用SV总RNA纯化系统试剂盒提取总RNA，在紫外分光光度计中测OD260、OD280值，计算RNA浓度和含量，OD260/280在1.8～2.0之间。采用反转录系统试剂盒进行mRNA反转录反应，总体系20 ?L：9.9 ?L（含1 ?g）RNA模板， MgCl2 25 mmol/L 4 ?L，反转录10×buffer 2 ?L，dnTp混合物10 mmol/L 2 ?L，重组的NRasin核糖核酶抑制剂0.5 ?L，AMV反转录酶（高浓度）0.6 ?L，Oligo（dT）15引物1 ?L。37 ℃、1 h， 95 ℃、3 min，合成的cDNA以无RNA酶水稀释5倍，置-20 ℃备用。 2.3.2 引物合成 通过检索NCBI（美国国家生物技术信息中心）获得小鼠ZO-1 mRNA基因序列，引物交由北京奥科鼎盛生物科技有限公司设计并合成。5’ primer：AGGACACCAAAGCATGTGAG， 3’primer：GGCATTCCTGCTG GTTACA，扩增片段长度86 bp；内参β-actin：Forward 5'-AGGCCAACCGTGAAAAGATG-3'，Reverse 5'-TGGCGTGAGGGAGAGCATAG-3'，扩增片段长度185 bp。
2.3.3 反应体系及反应条件 总反应体系25 ?L，其中2×mix 12.5 ?L，无RNA酶水5.5 ?L，cDNA 5 ?L，上游引物1 ?L
（10 ?mol/L），下游引物1 ?L（10 ?mol/L），反应条件：95 ℃、10 min预变性；然后95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40次循环。反应结束计算机自动计算CT值。
2.3.4 扩增效率标准曲线、熔解曲线和扩增曲线 每个引物均把CDNA按倍比稀释5次（1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32），每浓度3个复孔，以CT值为纵坐标、稀释倍数的对数为横坐标建立标准曲线。观察熔解曲线和扩增曲线，了解目的基因扩增中是否有非特异性扩增产物及引物二聚体。
2.4 Western blot
细胞以1×105细胞/mL接种于6孔板，培养48 h，细胞裂解液（15 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，0.2% TritonX-100，150 mmol/L NaCl）裂解细胞，收集细胞蛋白提取液。10% SDS-PAGE，加入 ZO-1抗体（Invitrogen公司）4 ℃反应过夜；加入第二抗体辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（Santa Cruz公司）室温反应2 h，进行ECL显色。Genegenome凝胶成像系统（Syngene公司）采集图像，采用Image J（NIH image，MD）进行图像分析。
3 统计学方法
采用SPSS10.0统计软件进行分析，数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
4 结果
4.1 标准曲线、熔解曲线和扩增曲线
求得标准曲线，基因扩增效率（Eff）=95.2%，相关系数r2=0.999，可见引物的Eff在100%±10%之间，r2>0.98，呈良好的线性关系，定量结果准确可靠。各组目的基因PCR产物的扩增曲线曲线平滑，有明显的指数扩增期；熔解曲线为单特异峰，Tm值均>80 ℃，说明没有引物二聚体及非特异性扩增产物。
4.2 胞质紧密黏连蛋白1基因转录量
CT值表示每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，根据2-△△CT法求出初始cDNA的相对量。结果见表1。
4.2 胞质紧密黏连蛋白1蛋白表达量
与正常组相比，模型组ZO-1表达量降低57.71%，表明铝暴露能显著抑制脑微血管内皮细胞ZO-1蛋白的表达（P<0.01）。与模型组相比，低、中、高剂量的三七总皂苷分别使ZO-1的表达量提高0.078、0.529、1.406倍。其中，三七总皂苷中、高剂量组可显著提高铝离子损伤后细胞ZO-1蛋白的表达，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。此外，从数据可见，三七总皂苷增加ZO-1蛋白的表达具有剂量依赖性，以高剂量组效果最显著，表达量可恢复至正常水平。见图1、表2。
5 讨论
神经退行性疾病最大的危险因素是老龄[8]，年龄与血管的退行性改变密切相关[9]，AD脑内Aβ的聚积随年龄增大呈加速之势[10]。而金属暴露随时间的延长也具有一定累积性，对机体组织的损害成渐进性，这一点比较符合晚发型AD的特点[11]。因此，金属暴露与AD的发病引起了国内外众多学者的关注[12]。
铝本身就是一种具有神经毒性的元素，可通过慢性蓄积作用于中枢神经系统，损害人的学习与记忆功能[13]。通过活检及尸检发现，AD患者脑内铝的含量明显高于对照组；职业铝暴露可以产生与AD相同的脑组织变化，导致类似AD的细胞凋亡，使神经纤维缠结增加，Aβ产生增多，斑块沉积[14]。铝从血循环进入脑内必须经过BBB，而BBB是循环系统和中枢神经系统之间的一个复杂的动态调节界面，控制着血液中的成分进入脑组织中，可以有选择性地让一些必需分子进入。几乎所有的蛋白质和大分子物质都不能通过BBB，因此，铝跨越BBB及对BBB的影响是铝引发脑内一系列病理生理改变的核心和基础[5]。
近年的研究发现，铝暴露可影响BBB的屏障功能[15]，BBB的屏障功能对于维持脑内环境的稳定至关重要[16]。Banks等[17]证实，Al-Aβ42复合物的血脑通过率较单独的Aβ42明显增加，这提示铝能够协助Aβ通过BBB，但其具体机制尚未阐明。
BBB主要由脑微血管内皮细胞组成，脑微血管内皮细胞间的紧密连接是构成BBB最主要的结构和功能基础，它能够封闭内皮细胞顶部的细胞间隙，阻止细胞外的大分子物质经细胞间隙进入组织内[18]。研究表明，铝可以降低紧密连接跨膜蛋白occludin、claudin5和细胞骨架蛋白F-actin的表达[19-20]，这一结果提示铝的神经毒性可能与减少脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白表达，削弱BBB屏障功能有关，进而引发脑内代谢失衡，损伤神经细胞。因此，我们推测BBB的破坏，尤其是脑微血管内皮细胞紧密连接的损伤是铝引发AD的可能病因之一。
胞质蛋白是紧密连接的重要组成蛋白，能将跨膜蛋白和细胞骨架蛋白连接在一起，对紧密连接的形成起着类似组装平台的作用[21]。ZO-1是第一个被证实的紧密连接胞质蛋白，是膜结合鸟苷酸激酶同系物家族中惟一可形成高度稳定二聚体的蛋白。正常情况下，ZO-1在细胞膜表面表达，并且在胞质内有多个结合位点，对维持紧密连接的连续性和完整性发挥重要作用，ZO-1的缺失及分裂与BBB通透性的改变密切相关[22]。 本研究结果显示，铝可以抑制体外培养的小鼠脑微血管内皮细胞ZO-1的转录及表达，并呈一定的量效关系。由此可见，铝不但可抑制BBB紧密连接跨膜蛋白occludin和细胞骨架蛋白F-actin的表达[19-20]，同时还能显著降低紧密连接胞质蛋白ZO-1的表达，从结构上破坏BBB的完整性，因此，必然会使BBB的屏障功能受到破坏。
目前，在经典治疗方式不能有效治疗AD的现实情况下，铝螯合剂能够从一定程度上改善AD的病情[23]，这进一步提示铝与AD的发生、发展及预后密切相关。但由于铝螯合剂较大的不良反应而限制了其在临床的应用。而传统中医药对老年慢性疾病的防治一向有其独特的见解及治疗优势。中医理论认为，老年人由于脏腑虚损、阴阳失衡、脏腑功能紊乱、营卫失衡、气血运行失常等导致体内的有害物质不能及时排出，“久病入络”，“毒损脑络，络损神伤”[24]。脑微血管的功能和特性类似中医中的脑络。中药三七具有益气、活血、化瘀之功效，由于其突出的脑血循环改善作用，因此被广泛应用于脑血管疾病的临床治疗中。研究表明，三七的主要药效成分三七总皂苷对AD模型动物有良好的治疗作用[6]。这可能与三七总皂苷补益气血、调和营卫、扶正抑邪、疏通脑络、进而恢复AD脑微血管内皮之屏障功能有关，而我们的实验也表明三七总皂苷能够增加铝暴露下脑微血管内皮细胞紧密连接的重要组成蛋白ZO-1的表达。
参考文献：
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（收稿日期：2012-02-21，编辑：华强）
关键词：老年痴呆；铝暴露；三七总皂苷；胞质紧密黏连蛋白1
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）09-0036-04
虽然老年痴呆（Alzheimer’s disease，AD）发病的确切病因尚未明确，但可以肯定的是AD是一多种因素引发的进行性神经退行性疾病[1]。在众多因素中，铝离子暴露一直是人们关注最多的致病因素之一[2]。AD的标志性病理特征是脑内淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）形成的淀粉样斑块，铝可以通过改变Aβ的构象，并抑制降解Aβ的酶，从而促进Aβ的脑内沉积，导致神经元凋亡[3]。因此，采用铝暴露可以成功模拟出与AD病理改变类似的动物模型[4]。目前，大多数研究集中于揭示铝在脑内与Aβ共同作用或协助Aβ沉积产生神经毒性的机制，而铝对脑微血管内皮细胞作用的研究涉及很少。脑微血管内皮细胞是血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）结构及功能的基础，而血循环中铝最先遇到的是BBB，铝跨越BBB及对BBB的影响是铝引发脑内一系列病理生理改变的核心[5]。中药三七具有散瘀止血、消肿定痛之功效，被广泛应用于脑血管疾病的临床治疗中，其主要药效成分三七总皂苷对AD模型动物有良好的治疗作用[6]。本研究通过观察铝暴露下脑微血管内皮细胞中胞质紧密黏连蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）的变化，初步探讨铝对BBB的可能影响，从另一角度揭示三七总皂苷治疗AD的可能机制及靶点。
1 实验材料
1.1 细胞
小鼠脑微血管内皮细胞系Balb/c（中日友好医院娄晋宁教授惠赠，经抗Ⅷ因子抗体、抗CD31抗体及DiI-乙酰化低密度脂蛋白标记摄取检测，符合内皮细胞特性[7]）。
1.2 主要药物及试剂
注射用血塞通（冻干），400 mg/支，昆明制药集团股份有限公司，批号09HA05；三氯化铝（AlCl3）纯度≥99.0%，分子量133.34，Sigma公司，批号139757554408171）；铝螯合剂（1，2-二甲基-3-羟基-4-吡啶酮，DHPO；分子量139.15，Sigma公司，批号STBD1101）；胎牛血清（Invitrogen公司）；内皮细胞生长因子（由中日友好医院临床研究所病理生理室提取）；总RNA纯化系统试剂盒、反转录系统试剂盒（Promega公司）；Power Sybr Green PCR Master Mix（ABI公司）；PVDF膜（Millipore公司）；RIPA裂解液（普利莱基因公司）；ECL发光液（上海碧云天生物技术有限公司）；蛋白质Marker（Fermentas 公司）；Cocktail蛋白酶抑制剂、PhosSTOP磷酸酶抑制剂（Roche 公司）；BCA蛋白定量测定试剂盒（北京赛驰生物科技有限公司公司）。
1.3 主要仪器
Mx3000p定量PCR仪（ZA29-Mx3000P，Stratagene公司）；倒置相差显微镜（Olympus IMT-2）；高速冷冻离心机（HC-3018R，科大创新）；CO2培养箱（MCO-20AIC，SANYO公司），可见光紫外分光光度计（Multispec1501，岛津公司）；Genegenome凝胶成像系统（Syngene公司）；BioRad Mini-4垂直电泳槽和转膜仪（Biorad公司）；Genegenome凝胶成像系统（Syngene公司）。
2 实验方法
2.1 脑微血管内皮细胞的复苏、培养和传代
从液氮中取出细胞冻存管，37 ℃水浴箱迅速融化，传至已用明胶包被的75 cm2的培养瓶中，放入适量的内皮细胞培养基（DMEM培养基中添加20%胎牛血清、谷氨酰胺2 mmol/L、青霉素100 000 U/L、链霉素100 mg/L、肝素40 000 U/L、内皮细胞生长因子100 mg/L），37 ℃、5%CO2培养箱培养，1～2 d换液，3～4 d传代1次，用胰酶消化细胞。实验采用第24代细胞。
2.2 分组
将单细胞悬液接种于60 mm培养皿中，每皿5×105 mL个细胞，加培养基4 mL，置CO2培养箱中孵育，待细胞90%以上融合时随机分为正常对照组（DMEM培养基）、模型组（DMEM培养基中含AlCl3 125 ?g/mL）、阳性对照组（DMEM 培养基中含铝螯合剂30 ?g/mL）及三七总皂苷低、中、高剂量组（DMEM 培养基中分别含三七总皂苷25、50、100 ?g/mL）。每组设6个复孔，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。
2.3 荧光实时定量PCR反应
2.3.1 总RNA提取 各组培养24 h后弃液，将消化的单细胞混悬液收集于EP管中，采用SV总RNA纯化系统试剂盒提取总RNA，在紫外分光光度计中测OD260、OD280值，计算RNA浓度和含量，OD260/280在1.8～2.0之间。采用反转录系统试剂盒进行mRNA反转录反应，总体系20 ?L：9.9 ?L（含1 ?g）RNA模板， MgCl2 25 mmol/L 4 ?L，反转录10×buffer 2 ?L，dnTp混合物10 mmol/L 2 ?L，重组的NRasin核糖核酶抑制剂0.5 ?L，AMV反转录酶（高浓度）0.6 ?L，Oligo（dT）15引物1 ?L。37 ℃、1 h， 95 ℃、3 min，合成的cDNA以无RNA酶水稀释5倍，置-20 ℃备用。 2.3.2 引物合成 通过检索NCBI（美国国家生物技术信息中心）获得小鼠ZO-1 mRNA基因序列，引物交由北京奥科鼎盛生物科技有限公司设计并合成。5’ primer：AGGACACCAAAGCATGTGAG， 3’primer：GGCATTCCTGCTG GTTACA，扩增片段长度86 bp；内参β-actin：Forward 5'-AGGCCAACCGTGAAAAGATG-3'，Reverse 5'-TGGCGTGAGGGAGAGCATAG-3'，扩增片段长度185 bp。
2.3.3 反应体系及反应条件 总反应体系25 ?L，其中2×mix 12.5 ?L，无RNA酶水5.5 ?L，cDNA 5 ?L，上游引物1 ?L
（10 ?mol/L），下游引物1 ?L（10 ?mol/L），反应条件：95 ℃、10 min预变性；然后95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40次循环。反应结束计算机自动计算CT值。
2.3.4 扩增效率标准曲线、熔解曲线和扩增曲线 每个引物均把CDNA按倍比稀释5次（1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32），每浓度3个复孔，以CT值为纵坐标、稀释倍数的对数为横坐标建立标准曲线。观察熔解曲线和扩增曲线，了解目的基因扩增中是否有非特异性扩增产物及引物二聚体。
2.4 Western blot
细胞以1×105细胞/mL接种于6孔板，培养48 h，细胞裂解液（15 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，0.2% TritonX-100，150 mmol/L NaCl）裂解细胞，收集细胞蛋白提取液。10% SDS-PAGE，加入 ZO-1抗体（Invitrogen公司）4 ℃反应过夜；加入第二抗体辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（Santa Cruz公司）室温反应2 h，进行ECL显色。Genegenome凝胶成像系统（Syngene公司）采集图像，采用Image J（NIH image，MD）进行图像分析。
3 统计学方法
采用SPSS10.0统计软件进行分析，数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
4 结果
4.1 标准曲线、熔解曲线和扩增曲线
求得标准曲线，基因扩增效率（Eff）=95.2%，相关系数r2=0.999，可见引物的Eff在100%±10%之间，r2>0.98，呈良好的线性关系，定量结果准确可靠。各组目的基因PCR产物的扩增曲线曲线平滑，有明显的指数扩增期；熔解曲线为单特异峰，Tm值均>80 ℃，说明没有引物二聚体及非特异性扩增产物。
4.2 胞质紧密黏连蛋白1基因转录量
CT值表示每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，根据2-△△CT法求出初始cDNA的相对量。结果见表1。
4.2 胞质紧密黏连蛋白1蛋白表达量
与正常组相比，模型组ZO-1表达量降低57.71%，表明铝暴露能显著抑制脑微血管内皮细胞ZO-1蛋白的表达（P<0.01）。与模型组相比，低、中、高剂量的三七总皂苷分别使ZO-1的表达量提高0.078、0.529、1.406倍。其中，三七总皂苷中、高剂量组可显著提高铝离子损伤后细胞ZO-1蛋白的表达，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。此外，从数据可见，三七总皂苷增加ZO-1蛋白的表达具有剂量依赖性，以高剂量组效果最显著，表达量可恢复至正常水平。见图1、表2。
5 讨论
神经退行性疾病最大的危险因素是老龄[8]，年龄与血管的退行性改变密切相关[9]，AD脑内Aβ的聚积随年龄增大呈加速之势[10]。而金属暴露随时间的延长也具有一定累积性，对机体组织的损害成渐进性，这一点比较符合晚发型AD的特点[11]。因此，金属暴露与AD的发病引起了国内外众多学者的关注[12]。
铝本身就是一种具有神经毒性的元素，可通过慢性蓄积作用于中枢神经系统，损害人的学习与记忆功能[13]。通过活检及尸检发现，AD患者脑内铝的含量明显高于对照组；职业铝暴露可以产生与AD相同的脑组织变化，导致类似AD的细胞凋亡，使神经纤维缠结增加，Aβ产生增多，斑块沉积[14]。铝从血循环进入脑内必须经过BBB，而BBB是循环系统和中枢神经系统之间的一个复杂的动态调节界面，控制着血液中的成分进入脑组织中，可以有选择性地让一些必需分子进入。几乎所有的蛋白质和大分子物质都不能通过BBB，因此，铝跨越BBB及对BBB的影响是铝引发脑内一系列病理生理改变的核心和基础[5]。
近年的研究发现，铝暴露可影响BBB的屏障功能[15]，BBB的屏障功能对于维持脑内环境的稳定至关重要[16]。Banks等[17]证实，Al-Aβ42复合物的血脑通过率较单独的Aβ42明显增加，这提示铝能够协助Aβ通过BBB，但其具体机制尚未阐明。
BBB主要由脑微血管内皮细胞组成，脑微血管内皮细胞间的紧密连接是构成BBB最主要的结构和功能基础，它能够封闭内皮细胞顶部的细胞间隙，阻止细胞外的大分子物质经细胞间隙进入组织内[18]。研究表明，铝可以降低紧密连接跨膜蛋白occludin、claudin5和细胞骨架蛋白F-actin的表达[19-20]，这一结果提示铝的神经毒性可能与减少脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白表达，削弱BBB屏障功能有关，进而引发脑内代谢失衡，损伤神经细胞。因此，我们推测BBB的破坏，尤其是脑微血管内皮细胞紧密连接的损伤是铝引发AD的可能病因之一。
胞质蛋白是紧密连接的重要组成蛋白，能将跨膜蛋白和细胞骨架蛋白连接在一起，对紧密连接的形成起着类似组装平台的作用[21]。ZO-1是第一个被证实的紧密连接胞质蛋白，是膜结合鸟苷酸激酶同系物家族中惟一可形成高度稳定二聚体的蛋白。正常情况下，ZO-1在细胞膜表面表达，并且在胞质内有多个结合位点，对维持紧密连接的连续性和完整性发挥重要作用，ZO-1的缺失及分裂与BBB通透性的改变密切相关[22]。 本研究结果显示，铝可以抑制体外培养的小鼠脑微血管内皮细胞ZO-1的转录及表达，并呈一定的量效关系。由此可见，铝不但可抑制BBB紧密连接跨膜蛋白occludin和细胞骨架蛋白F-actin的表达[19-20]，同时还能显著降低紧密连接胞质蛋白ZO-1的表达，从结构上破坏BBB的完整性，因此，必然会使BBB的屏障功能受到破坏。
目前，在经典治疗方式不能有效治疗AD的现实情况下，铝螯合剂能够从一定程度上改善AD的病情[23]，这进一步提示铝与AD的发生、发展及预后密切相关。但由于铝螯合剂较大的不良反应而限制了其在临床的应用。而传统中医药对老年慢性疾病的防治一向有其独特的见解及治疗优势。中医理论认为，老年人由于脏腑虚损、阴阳失衡、脏腑功能紊乱、营卫失衡、气血运行失常等导致体内的有害物质不能及时排出，“久病入络”，“毒损脑络，络损神伤”[24]。脑微血管的功能和特性类似中医中的脑络。中药三七具有益气、活血、化瘀之功效，由于其突出的脑血循环改善作用，因此被广泛应用于脑血管疾病的临床治疗中。研究表明，三七的主要药效成分三七总皂苷对AD模型动物有良好的治疗作用[6]。这可能与三七总皂苷补益气血、调和营卫、扶正抑邪、疏通脑络、进而恢复AD脑微血管内皮之屏障功能有关，而我们的实验也表明三七总皂苷能够增加铝暴露下脑微血管内皮细胞紧密连接的重要组成蛋白ZO-1的表达。
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（收稿日期：2012-02-21，编辑：华强）