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李 青 邹 坤 汪鋆植
摘要目的：探讨开口箭提取物体外抗肿瘤作用。方法：采用四甲基偶氮唑盐(MTF)比色法。结果：开口箭提取物、总皂苷、30％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分对人宫颈癌Hela细胞和人鼻咽癌CNE一1细胞的抑制作用明显，与阴性对照组比差异有显著性(P<0.05，P<0.01)，对Hela细胞的IC50分别为114.99μg/ml、72.25μg/ml、39.40μg/ml和45.82μg/ml，对CNE-1细胞的IC50分别为106.82μg/ml、89.75μg/ml、60.72μg/ml和64.45μg/ml。结论：开口箭提取物体外有抗肿瘤作用。
关键词 开口箭 皂苷 MTT法 抗肿瘤
开口箭(Tupistra chinensisBak.)为百合科(Liliaceae)铃兰族开口箭属植物，为著名的传统中药，具有清热解毒、益气活血、散瘀止痛等多种功效，主治劳热咳嗽、跌打损伤、风湿痹痛等症，民间用于治疗咽喉炎、扁桃体炎等。现证明开口箭具有祛痰、抗炎、抑菌及醒酒作用。
本实验室通过实验证实湖北省产开口箭含有甾体皂苷和甾体皂苷元，且含量较高。皂苷具有增强免疫功能、抗辐射、抑制肿瘤生长、抗炎、降血糖等广泛的生物学活性，近年越来越受人们的普遍关注。有研究证实开口箭同属植物皂苷成分有细胞毒活性。本文旨在通过体外抗肿瘤实验，观察开口箭提取物对Hela和CNE-1细胞的增殖抑制作用，现将结果报告如下。
1 实验材料
1．1 细胞株
人宫颈癌细胞(Hela)和鼻咽癌细胞(CNE-1)均由三峡大学医学院免疫教研室提供。
1．2 药品与仪器
RPMI-1640为美国GIBCO公司产品；新生小牛血清为杭州四季青生物材料有限公司产品；HEPES为美国Sigma公司产品；胰蛋白酶为美国G1BCO公司产品；四氮唑蓝(MTT)为美国AMRESCO公司产品；丝裂霉素(MMC)为浙江海正药业股份有限公司产品；酶联免疫检测仪(GENIOSTECAN)；C02培养箱(日本三洋公司)；LIM-2A离心机(北京医用离心机厂)；96孔板(美国Coming公司)。
开口箭根茎于2002年7月采自湖北省神农架林区，经三峡大学化学与生命科学学院陈发菊副教授鉴定为Tupistra chinensisBak.，标本存放于湖北省天然产物研究与利用重点实验室(编号：TC200207SNJ)。
1．3 药物制备
开口箭根茎粉碎后，用甲醇回流提取3次，合并3次提取液，浓缩后经石油醚脱脂用水饱和的正丁醇萃取，旋转蒸发回收正丁醇，浓缩液抽干后即得到开口箭总皂苷，配成水液，过大孔树脂柱，水洗，30％乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，得开口箭四部分皂苷。
分别取开口箭甲醇提取物、总皂苷、30％乙醇洗脱部分、70％乙醇洗脱部分4个样品，用含10％灭活的新生小牛血清RP-MI-1640培养液将其配制成所需浓度，依次为62.5、125、250、500、1000、2000μg/ml。丝裂霉素(MMC)用含10％灭活的新生小牛血清RPMI-1640培养液将其配置为250μg/ml。所有受试样品均用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
2 实验方法
2．1 细胞培养
Hela和CNE-1细胞用RP-MI-1640培养液(另加10mM HEPES、2.0mg/mlNaHCO3、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％新生小牛血清)，于CO2孵箱中37℃、5％CO2饱和湿度下培养。细胞用含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化传代。
2．2 MTY比色法
MTT比色法按Mosmann氏法略加改进。将处于对数生长期的细胞制成单个细胞悬液，调整细胞浓度为0.8×105个／ml，接种于96孔培养板，每孔接种180μl，转板6h后加20μl受试药，另设阴性对照组(不加药)、空白调零组(只有培养基)和阳性对照组(MMC组)，每组均设6个复孔，培养48h后加MTT(5mg/ml)15μl，继续培养4h后，弃去上清液，加DMSO 100μl，用全自动酶联免疫检测仪于492nm波长处测定吸光度(OD)值，求出IC50。抑制率(％)=[1-(实验组OD均值-空白组OD均值)／(对照组OD均值-空白组OD均值)]×100％。
2．3 统计学处理
实验数据以x±s表示，数据分析采用SPSS11.5统计软件进行。用Origin软件，通过半对数抑合直线求IC50值。
3 实验结果
3．1 开口箭总提取物和总皂苷对Hela细胞的影响。
可知开口箭总提取物和总皂苷对Hela细胞的抑制作用显著，与阴性对照组相比有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，且呈良好的量效关系，随着药物浓度的增加，抑制效果越明显。
3．2 开口箭30％乙醇洗脱部分和开口箭70％乙醇洗脱部分对Hela细胞的影响。
由表2可知开口箭30％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分对Hela细胞的抑制作用显著，与阴性对照组比有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。30％乙醇洗脱部分最佳作用浓度为1001μg／ml，其抑制率达80.70％，70％乙醇洗脱部分最佳作用浓度为501μg／ml，其抑制率达73.00％。
3．3 开口箭总提取物和总皂苷对CNE－I细胞的影响。
由表可知开口箭总提取物和总皂苷对CNE-1细胞的抑制作用较明显，与阴性对照组比有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，且呈良好的量效关系，抑制效果随药物浓度的增大而增强。
3．4 开口箭30％乙醇洗脱部分和开口箭70％乙醇洗脱部分对CNE-l细胞的影响。
由表可知，开口箭30％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分对CNE-1细胞抑制作用显著，与阴性对照组比有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。其中30％乙醇洗脱部分对CNE-l细胞的增殖抑制与药物浓度成正相关，70％乙醇洗脱部分在50μg/ml对CNE-1细胞的抑制效果最佳。
4 讨论
以上结果表明，开口箭甲醇提取物、总皂苷、30％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分对Hela和CNE-1细胞株的增殖均有较强的抑制作用，且有统计学差异，其细胞毒作用呈现一定程度的剂量依赖性。其中开口箭总皂苷、30％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分对Hela细胞作用48h的IC50值分别为72.25、39.40和45.82μg/ml，对CNE-1细胞作用48h的IC50值分别为89.75、60.72和64.45μg/ml，亦符合IC50<1001μg/ml认为有用的要求。药理实验显示开口箭毒副作用小，因此开发其细胞毒作用有潜在价值。
开口箭总皂苷上大孔树脂柱所得95％开口箭皂苷部分量较少，目前正在研究之中。至于不同的开口箭部位细胞毒活性存在差异，应与它们所含不同皂苷成分有关，还需要对其进行深入研究。
从植物中寻找抗肿瘤药物及抗肿瘤辅助药物，在国内外均为抗肿瘤药物研究的重要组成部分。据文献报道开口箭对HepG2和S180细胞株亦有明显的抑制作用，本实验室发现开口箭对HL-60和Caski细胞有较强的抑制作用，可见开口箭具有广谱抗肿瘤作用，此外开口箭还有祛痰抗炎等作用。因此对开口箭的体外抗肿瘤作用及机制值得进一步研究。
摘要目的：探讨开口箭提取物体外抗肿瘤作用。方法：采用四甲基偶氮唑盐(MTF)比色法。结果：开口箭提取物、总皂苷、30％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分对人宫颈癌Hela细胞和人鼻咽癌CNE一1细胞的抑制作用明显，与阴性对照组比差异有显著性(P<0.05，P<0.01)，对Hela细胞的IC50分别为114.99μg/ml、72.25μg/ml、39.40μg/ml和45.82μg/ml，对CNE-1细胞的IC50分别为106.82μg/ml、89.75μg/ml、60.72μg/ml和64.45μg/ml。结论：开口箭提取物体外有抗肿瘤作用。
关键词 开口箭 皂苷 MTT法 抗肿瘤
开口箭(Tupistra chinensisBak.)为百合科(Liliaceae)铃兰族开口箭属植物，为著名的传统中药，具有清热解毒、益气活血、散瘀止痛等多种功效，主治劳热咳嗽、跌打损伤、风湿痹痛等症，民间用于治疗咽喉炎、扁桃体炎等。现证明开口箭具有祛痰、抗炎、抑菌及醒酒作用。
本实验室通过实验证实湖北省产开口箭含有甾体皂苷和甾体皂苷元，且含量较高。皂苷具有增强免疫功能、抗辐射、抑制肿瘤生长、抗炎、降血糖等广泛的生物学活性，近年越来越受人们的普遍关注。有研究证实开口箭同属植物皂苷成分有细胞毒活性。本文旨在通过体外抗肿瘤实验，观察开口箭提取物对Hela和CNE-1细胞的增殖抑制作用，现将结果报告如下。
1 实验材料
1．1 细胞株
人宫颈癌细胞(Hela)和鼻咽癌细胞(CNE-1)均由三峡大学医学院免疫教研室提供。
1．2 药品与仪器
RPMI-1640为美国GIBCO公司产品；新生小牛血清为杭州四季青生物材料有限公司产品；HEPES为美国Sigma公司产品；胰蛋白酶为美国G1BCO公司产品；四氮唑蓝(MTT)为美国AMRESCO公司产品；丝裂霉素(MMC)为浙江海正药业股份有限公司产品；酶联免疫检测仪(GENIOSTECAN)；C02培养箱(日本三洋公司)；LIM-2A离心机(北京医用离心机厂)；96孔板(美国Coming公司)。
开口箭根茎于2002年7月采自湖北省神农架林区，经三峡大学化学与生命科学学院陈发菊副教授鉴定为Tupistra chinensisBak.，标本存放于湖北省天然产物研究与利用重点实验室(编号：TC200207SNJ)。
1．3 药物制备
开口箭根茎粉碎后，用甲醇回流提取3次，合并3次提取液，浓缩后经石油醚脱脂用水饱和的正丁醇萃取，旋转蒸发回收正丁醇，浓缩液抽干后即得到开口箭总皂苷，配成水液，过大孔树脂柱，水洗，30％乙醇、70％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，得开口箭四部分皂苷。
分别取开口箭甲醇提取物、总皂苷、30％乙醇洗脱部分、70％乙醇洗脱部分4个样品，用含10％灭活的新生小牛血清RP-MI-1640培养液将其配制成所需浓度，依次为62.5、125、250、500、1000、2000μg/ml。丝裂霉素(MMC)用含10％灭活的新生小牛血清RPMI-1640培养液将其配置为250μg/ml。所有受试样品均用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
2 实验方法
2．1 细胞培养
Hela和CNE-1细胞用RP-MI-1640培养液(另加10mM HEPES、2.0mg/mlNaHCO3、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％新生小牛血清)，于CO2孵箱中37℃、5％CO2饱和湿度下培养。细胞用含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化传代。
2．2 MTY比色法
MTT比色法按Mosmann氏法略加改进。将处于对数生长期的细胞制成单个细胞悬液，调整细胞浓度为0.8×105个／ml，接种于96孔培养板，每孔接种180μl，转板6h后加20μl受试药，另设阴性对照组(不加药)、空白调零组(只有培养基)和阳性对照组(MMC组)，每组均设6个复孔，培养48h后加MTT(5mg/ml)15μl，继续培养4h后，弃去上清液，加DMSO 100μl，用全自动酶联免疫检测仪于492nm波长处测定吸光度(OD)值，求出IC50。抑制率(％)=[1-(实验组OD均值-空白组OD均值)／(对照组OD均值-空白组OD均值)]×100％。
2．3 统计学处理
实验数据以x±s表示，数据分析采用SPSS11.5统计软件进行。用Origin软件，通过半对数抑合直线求IC50值。
3 实验结果
3．1 开口箭总提取物和总皂苷对Hela细胞的影响。
可知开口箭总提取物和总皂苷对Hela细胞的抑制作用显著，与阴性对照组相比有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，且呈良好的量效关系，随着药物浓度的增加，抑制效果越明显。
3．2 开口箭30％乙醇洗脱部分和开口箭70％乙醇洗脱部分对Hela细胞的影响。
由表2可知开口箭30％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分对Hela细胞的抑制作用显著，与阴性对照组比有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。30％乙醇洗脱部分最佳作用浓度为1001μg／ml，其抑制率达80.70％，70％乙醇洗脱部分最佳作用浓度为501μg／ml，其抑制率达73.00％。
3．3 开口箭总提取物和总皂苷对CNE－I细胞的影响。
由表可知开口箭总提取物和总皂苷对CNE-1细胞的抑制作用较明显，与阴性对照组比有显著性差异(P<0.05或P<0.01)，且呈良好的量效关系，抑制效果随药物浓度的增大而增强。
3．4 开口箭30％乙醇洗脱部分和开口箭70％乙醇洗脱部分对CNE-l细胞的影响。
由表可知，开口箭30％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分对CNE-1细胞抑制作用显著，与阴性对照组比有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。其中30％乙醇洗脱部分对CNE-l细胞的增殖抑制与药物浓度成正相关，70％乙醇洗脱部分在50μg/ml对CNE-1细胞的抑制效果最佳。
4 讨论
以上结果表明，开口箭甲醇提取物、总皂苷、30％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分对Hela和CNE-1细胞株的增殖均有较强的抑制作用，且有统计学差异，其细胞毒作用呈现一定程度的剂量依赖性。其中开口箭总皂苷、30％乙醇洗脱部分和70％乙醇洗脱部分对Hela细胞作用48h的IC50值分别为72.25、39.40和45.82μg/ml，对CNE-1细胞作用48h的IC50值分别为89.75、60.72和64.45μg/ml，亦符合IC50<1001μg/ml认为有用的要求。药理实验显示开口箭毒副作用小，因此开发其细胞毒作用有潜在价值。
开口箭总皂苷上大孔树脂柱所得95％开口箭皂苷部分量较少，目前正在研究之中。至于不同的开口箭部位细胞毒活性存在差异，应与它们所含不同皂苷成分有关，还需要对其进行深入研究。
从植物中寻找抗肿瘤药物及抗肿瘤辅助药物，在国内外均为抗肿瘤药物研究的重要组成部分。据文献报道开口箭对HepG2和S180细胞株亦有明显的抑制作用，本实验室发现开口箭对HL-60和Caski细胞有较强的抑制作用，可见开口箭具有广谱抗肿瘤作用，此外开口箭还有祛痰抗炎等作用。因此对开口箭的体外抗肿瘤作用及机制值得进一步研究。