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【中图分类号】R488+3【文献标识码】A【文章编号】1005-0515(2010)010-0042-01
酶联免疫吸附试验(ELISA)法广泛用于乙型肝炎(下称乙肝)两对半检测。但其测定影响因素较多,有些因素会导致结果假阳性或假阴性,本文就ELISA测定乙肝两对半的影响因素及对策作如下讨论。
1 样本采集与处理的影响
1.1 标本严重溶血及混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净,残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样的活性,催化底物显色造成假阳性,严重溶血标本禁用。
1.2 采血试管洗涤不彻底、反复使用交叉污染。塑料试管能吸附抗原物质,样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。最好使用一次性玻璃试管或真空采血管。并使用非抗凝标本。
1.3 标本凝固不全,正常血液采集后30 min~2 h开始凝固,18~24 h血块完全收缩。在工作中,有时为了快速检测,常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清,使血清中仍残留部分纤维蛋白原,在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块或附着在酶标板孔壁内使酶标记物不易洗掉,易造成假阳(阴)性结果。因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清,或标本采集时用带分离胶的采血管中加提取。
2 试剂的影响
2.1 乙肝两对半试剂厂家较多,不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别。资料显示,不同厂家试剂的特异性和敏感性也不尽相同,有的厂家酶标板孔间A值差>15%,标记酶的活性及显色液的稳定比较差[1]。使用劣质试剂必然导致结果的假阳性或假阴性,选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。
2.2 不同方法学的检测试剂会使两对半结果出现一些不同。例如:在实际工作中常用ELISA法检测乙肝病毒表面抗原(HBsAg)结果为阴性,而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外,还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异,建议试剂厂家对试剂的制备应该考虑亚型及浓度的问题。
3 操作技术的影响
3.1 加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性,直接影响检测结果。由于吸嘴构造特殊,导致清洗困难,加大了交叉污染的机会,建议用一次性吸嘴。加样器也要经常清洗,定期校准。
3.2 温浴影响。96孔酶标板结构特别,易产生边缘效应,抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求,酶标板周围与内部孔升降温速率不同,造成周边与内部孔结果差异。干浴与水浴存在明显的差异,尽可能使用水浴,并要求固相板放入水中,减少受热不均,贴密封膜,防止污物浸入。
3.3 洗涤是ELISA操作的重要环节,手洗条件一致性较差,对结果影响较大,半自动与全自动洗板机使用不当也会影响结果。血清中残留的纤维蛋白丝或洗涤液析出结晶易使洗板机针孔全阻塞或半阻塞,造成未结合标记酶洗脱不彻底,导致“花板”造成假阳性或假阴性。所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况,及时纠正,洗板机不用时应用去离子水清洗几遍。
3.4 肉眼判断结果时,显色浅不易观察,影响结果的准确性,必须使用酶标仪检测结果,以保证结果一致性。
4 HOOK效应影响
随着ELISA一步法的应用,一些标本中抗原含量过高,产生HOOK效应,影响检测结果。采用同步稀释测定或使用线性范围高的两对半定量法可以减少HOOK反应的发生。
5 干扰物质的影响
有学者认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质,可以不同程度影响检测结果。常见的干扰物质有:类风湿因子(RF)、甲胎蛋白(AFP)因子。某些自身抗体都会影响结果造成假阳性[2]。常见的干扰物质有:类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig(s)抗体、交叉反应物质等。如RF因子可与标记二抗的FC法结合造成假阳性,补体从C1q活化,使一抗和酶标二抗的抗体分子发生变构,Fc的C1q分子结合点暴露出来,则补体C1q可将二者连接起来造成假阳性,采用56℃30 min灭活补体可降低假阳性率,高浓度的甲胎蛋白(如孕妇)在储存过程中可能形成二聚体会导致本底过深影响检测结果。
6 药物的影响
高效价的乙肝免疫球蛋白会与HBsAg形成复合物,影响HBsAg的检出,所以一些HBsAg阳性患者注射乙肝免疫球蛋白后,HBsAg检测会呈阴性反应,导致乙肝两对半少见模式的出现。如临床常遇到乙肝大三阳的孕妇,为阻断乙肝母婴垂直传播,在孕第8、9、10月常规注射200 mg乙肝免疫球蛋白,不仅影响孕妇HBsAg的检出,而且其分娩的生新儿也常
出现HBsAg阴性、乙肝病毒e抗原(HBeAg)阳性和乙肝病毒核心抗体(抗-HBc)阳性等少见模式。可能是乙肝免疫球蛋白属IgG抗体能通过胎盘进入胎儿体内与胎儿血液中的HBsAg结合形成复合物,新生儿HBsAg检测呈阴性,用0.5 m的盐酸处理标本1 h可提高检出率[3]。为预防乙肝,部分HBsAg阴性人群在接种乙肝疫苗后的1~2周内,血清中可检出HBsAg成分,形成一过性HBsAg阳性。这可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg有方法能够把它检出,如电化学发光法,建议接种乙肝疫苗后1个月内不应作HBsAg检测。
总之,乙肝两对半检测必须排除各种影响因素的干扰,其能为临床提供正确可靠的检测结果。
参考文献
[1] 许斌,朱虎定.ELISA检测HBsAg影响因素的探讨.临床检验杂志,2000,8(4):231~234
[2] 曹文飞.酶联免疫测定的干扰因素与对策.中国实验临床免疫学杂志,1998,10(3):60~61
[3] 林晨等.酸解离HBsAg免疫复合物以提高HBsAg检出率的探讨[J].上海医学检验,1995,10(3):167
作者单位:157012 黑龙江省牡丹江师范学院 医院
酶联免疫吸附试验(ELISA)法广泛用于乙型肝炎(下称乙肝)两对半检测。但其测定影响因素较多,有些因素会导致结果假阳性或假阴性,本文就ELISA测定乙肝两对半的影响因素及对策作如下讨论。
1 样本采集与处理的影响
1.1 标本严重溶血及混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净,残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样的活性,催化底物显色造成假阳性,严重溶血标本禁用。
1.2 采血试管洗涤不彻底、反复使用交叉污染。塑料试管能吸附抗原物质,样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。最好使用一次性玻璃试管或真空采血管。并使用非抗凝标本。
1.3 标本凝固不全,正常血液采集后30 min~2 h开始凝固,18~24 h血块完全收缩。在工作中,有时为了快速检测,常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清,使血清中仍残留部分纤维蛋白原,在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块或附着在酶标板孔壁内使酶标记物不易洗掉,易造成假阳(阴)性结果。因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清,或标本采集时用带分离胶的采血管中加提取。
2 试剂的影响
2.1 乙肝两对半试剂厂家较多,不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别。资料显示,不同厂家试剂的特异性和敏感性也不尽相同,有的厂家酶标板孔间A值差>15%,标记酶的活性及显色液的稳定比较差[1]。使用劣质试剂必然导致结果的假阳性或假阴性,选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。
2.2 不同方法学的检测试剂会使两对半结果出现一些不同。例如:在实际工作中常用ELISA法检测乙肝病毒表面抗原(HBsAg)结果为阴性,而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外,还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异,建议试剂厂家对试剂的制备应该考虑亚型及浓度的问题。
3 操作技术的影响
3.1 加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性,直接影响检测结果。由于吸嘴构造特殊,导致清洗困难,加大了交叉污染的机会,建议用一次性吸嘴。加样器也要经常清洗,定期校准。
3.2 温浴影响。96孔酶标板结构特别,易产生边缘效应,抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求,酶标板周围与内部孔升降温速率不同,造成周边与内部孔结果差异。干浴与水浴存在明显的差异,尽可能使用水浴,并要求固相板放入水中,减少受热不均,贴密封膜,防止污物浸入。
3.3 洗涤是ELISA操作的重要环节,手洗条件一致性较差,对结果影响较大,半自动与全自动洗板机使用不当也会影响结果。血清中残留的纤维蛋白丝或洗涤液析出结晶易使洗板机针孔全阻塞或半阻塞,造成未结合标记酶洗脱不彻底,导致“花板”造成假阳性或假阴性。所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况,及时纠正,洗板机不用时应用去离子水清洗几遍。
3.4 肉眼判断结果时,显色浅不易观察,影响结果的准确性,必须使用酶标仪检测结果,以保证结果一致性。
4 HOOK效应影响
随着ELISA一步法的应用,一些标本中抗原含量过高,产生HOOK效应,影响检测结果。采用同步稀释测定或使用线性范围高的两对半定量法可以减少HOOK反应的发生。
5 干扰物质的影响
有学者认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质,可以不同程度影响检测结果。常见的干扰物质有:类风湿因子(RF)、甲胎蛋白(AFP)因子。某些自身抗体都会影响结果造成假阳性[2]。常见的干扰物质有:类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig(s)抗体、交叉反应物质等。如RF因子可与标记二抗的FC法结合造成假阳性,补体从C1q活化,使一抗和酶标二抗的抗体分子发生变构,Fc的C1q分子结合点暴露出来,则补体C1q可将二者连接起来造成假阳性,采用56℃30 min灭活补体可降低假阳性率,高浓度的甲胎蛋白(如孕妇)在储存过程中可能形成二聚体会导致本底过深影响检测结果。
6 药物的影响
高效价的乙肝免疫球蛋白会与HBsAg形成复合物,影响HBsAg的检出,所以一些HBsAg阳性患者注射乙肝免疫球蛋白后,HBsAg检测会呈阴性反应,导致乙肝两对半少见模式的出现。如临床常遇到乙肝大三阳的孕妇,为阻断乙肝母婴垂直传播,在孕第8、9、10月常规注射200 mg乙肝免疫球蛋白,不仅影响孕妇HBsAg的检出,而且其分娩的生新儿也常
出现HBsAg阴性、乙肝病毒e抗原(HBeAg)阳性和乙肝病毒核心抗体(抗-HBc)阳性等少见模式。可能是乙肝免疫球蛋白属IgG抗体能通过胎盘进入胎儿体内与胎儿血液中的HBsAg结合形成复合物,新生儿HBsAg检测呈阴性,用0.5 m的盐酸处理标本1 h可提高检出率[3]。为预防乙肝,部分HBsAg阴性人群在接种乙肝疫苗后的1~2周内,血清中可检出HBsAg成分,形成一过性HBsAg阳性。这可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg有方法能够把它检出,如电化学发光法,建议接种乙肝疫苗后1个月内不应作HBsAg检测。
总之,乙肝两对半检测必须排除各种影响因素的干扰,其能为临床提供正确可靠的检测结果。
参考文献
[1] 许斌,朱虎定.ELISA检测HBsAg影响因素的探讨.临床检验杂志,2000,8(4):231~234
[2] 曹文飞.酶联免疫测定的干扰因素与对策.中国实验临床免疫学杂志,1998,10(3):60~61
[3] 林晨等.酸解离HBsAg免疫复合物以提高HBsAg检出率的探讨[J].上海医学检验,1995,10(3):167
作者单位:157012 黑龙江省牡丹江师范学院 医院