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【摘要】对硝基酚是人体接触硝基苯类同系物后体内产生的主要代谢产物，尿中对硝基酚浓度的测定，被认为是生物学监测和职业病诊断的重要指标。我们建立了高效液相色谱（荧光法）检测人体尿样中对硝基酚的新方法。本方法操作简单，不需程序梯度洗脱，不需柱前衍生，灵敏度高，检出限低，能够满足实际工作中含量较低的生物样品测定。
【关键词】尿样；应用荧光法；硝基酚
Application of assay in the human body in the urine of the contents of nitro
YUAN Bo
【Abstract】On nitrophenol is similar nitrobenzene of human contact after the body of the main metabolites, urinary concentrations of nitrophenols to the determination was considered the biological monitoring and diagnosis of occupational diseases as an important indicator. We have established a high-performance liquid chromatography (fluorescence) detected in the urine of human nitrophenol the new method. The method is simple, no gradient elution procedures, without pre-column derivatives, high sensitivity, low detection limits, to meet the actual work of a lower level of biological samples.
【Key words】Urine; application of fluorescence; Nitrophenol
近年来，有毒有害化学污染物对生态环境及人体健康的影响已引起人们高度重视〔1〕。对硝基酚是人体接触硝基苯类同系物后体内产生的主要代谢产物，尿中对硝基酚浓度的测定，被认为是生物学监测和职业病诊断的重要指标。尿中对硝基酚的测定方法有高效液相色谱法（紫外检测器）〔2〕及气相色谱法。气相色谱法需将对硝基酚转化成极性极小、挥发度较大的衍生物后再测定，操作复杂，要求较高。高效液相色谱法（紫外检测器）检测限一般为0.30mg/L左右，不适用于检测尿样中微量的对硝基酚。因此，我们建立了高效液相色谱（荧光法）检测人体尿样中对硝基酚的新方法。本方法操作简单，不需程序梯度洗脱，不需柱前衍生，灵敏度高，检出限低，能够满足实际工作中含量较低的生物样品测定。现报告如下：
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂。2690型高效液相色谱仪(HPLC)，附474型荧光检测器（美国Waters公司）；DK-S24型恒温水浴（100℃）；SHZ-III旋转蒸发器(上海精科实业有限公司)；ESJ200-4型电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）；828型酸度计（美国奥立龙公司）。二氯甲烷，分析纯（天津市光复精細化工研究所）；硼氢化钠，分析纯（上海山浦化工有限公司）；盐酸，优级纯（葫芦岛市渤海化学试剂厂）；乙醇，优级纯（天津化学试剂有限公司）；乙腈，色谱纯（山东禹王实业有限公司禹城化工厂）；磷酸二氢钾，分析纯(天津市化学试剂六厂）。
1.2 色谱条件。色谱柱为HYPERSIL C18(ODS)250×4.6 mm；流动相为乙睛：磷酸二氢钾缓冲液=65：35（pH=7）；流量1 ml/min；柱温55℃。
1.3 尿样的采集与保存。用聚乙烯瓶收集尿样，测比重，每100ml滴加3～4滴浓盐酸，贮于4℃冰箱中，可保存14 d。
1.4 实验方法。
1.4.1 标准溶液的配制。对硝基酚标准溶液（1 mg/ml）：称取对硝基酚标准品（美国Sigma公司）0.1000g，先溶于少量乙醇中，再用0.01mol/L盐酸定容至100ml棕色瓶中，摇匀，作为储备液。对氨基酚标准溶液（1mg/ml）：称取对氨基酚标准品（美国Sigma公司）0.1000g，先溶于少量乙醇中，再用0.01mol/L盐酸定容至100ml棕色瓶中，摇匀，作为储备液。
1.4.2 操作方法。取100ml尿液于25ml具塞比色管中，加2ml盐酸，混匀，加盖，置于沸水浴中加热1h；取出，冷却至室温，滤入分液漏斗中，加10ml二氯甲烷，震荡2min，静止分层后，分取有机相，每次用5ml二氯甲烷萃取2次，合并萃取液于旋转蒸发器中，旋转蒸发至干，用5ml乙醇分多次洗涤旋转蒸发瓶，溶液并入25ml比色管中。向比色管中加入0.2g硼氢化钠粉末，再分次加入2.5 ml的2mol/L盐酸溶液，进行还原反应，待反应停止后，先用酸度计调pH至2，再用0.01 mol/L盐酸定容至15 ml刻度，静止5 min。调激发波长和发射波长分别为271和371 nm，以乙腈和磷酸盐缓冲液作为流动相测定。
2 结果
2.1 还原条件的选择。
2.1.1 对氨基酚的荧光激发和发射波长。对硝基酚不发荧光，但可被硼氢化钠还原为发荧光的对氨基酚。经对对氨基酚的标准溶液进行荧光光谱扫描得知，对氨基酚的荧光激发波长和发射波长分别为271和371nm。
2.1.2 溶液酸度对荧光强度的影响 。取10 μg/ml对氨基酚标准溶液，用盐酸和氢氧化钠调节pH值分别为1，2，3，4，5，6。测定每种pH值下色谱峰面积值。结果表明，对氨基酚在pH值为2的盐酸介质中峰面积达最大且稳定。本试验选取pH=2进行测定。
2.1.3 硼氢化钠的用量。固定对硝基酚加入量100μg，加入0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 g不同量的硼氢化钠于比色管中。结果表明，当硼氢化钠用量为0.2 g时，荧光强度最大且稳定。本试验选择0.20 g硼氢化钠进行还原。
2.1.4 还原时酸的用量。固定对硝基酚加入量为100μg，硼氢化钠加入量0.20 g，分别加入0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 ml的2 mol/L盐酸进行实验。结果表明，加入2.5 ml 2 mol/L盐酸时，荧光强度最大，此时测得体系的pH值为1.99。在对硝基酚还原反应中，加入酸主要用于中和还原过程中产生的碱和使体系保持酸性。因此，选择合适的酸用量对于保持反应体系的稳定起重要作用。
2.2 色谱条件的选择：
2.2.1 流动相。在流速为1.0 ml/min条件下，分别试验了甲醇+水、乙腈+水、乙腈+磷酸二氢钾缓冲液（pH=7）几种流动相对对氨基酚的色谱荧光强度的影响。发现乙腈+磷酸二氢钾缓冲液（65：35，V/V）最好，且与其他峰得到了很好的分离。因此，本试验选择乙腈/磷酸二氢钾溶液（65：35，V/V）作为流动相。
2.2.2 检测限。以3倍仪器噪声的峰高相当的值为检测限时，本法的最低检出浓度为0.08 μg/ml。
2.2.3 相对标准偏差。对标准溶液对氨基酚连续进行11次平行测定。色谱峰面积分别为77438，77438，76258，74617，76138，75763，74466，74047，73165，73744，73923；均值为75181.545，标准差为1497.65，相对标准偏差(RSD)为1.99%。
2.3 尿中对硝基酚的测定。2005年松花江水受到硝基苯污染后，分别用高效液相色谱荧光法和高效液相色谱紫外检测法〔2〕对受污染地区人群尿样中对硝基酚含量进行了监测分析。同一样本在对硝基酚含量较高时，2种方法的结果一致，而在对硝基酚含量较低时，由于HPLC（紫外检测器）的检测限（0.31 μg/ml）较高而无法检测出真实的结果，而本方法因检测限（0.08 μg/ml）较低则较好地完成了检测分析，表明本研究适用于接触硝基苯及其同系物的人员尿中微量代谢产物对硝基酚的测定。
3 讨论
硝基苯及含有对硝基苯基的化合物进入人体后，主要代谢物为对硝基酚，但亦有少量对氨基酚共存于尿中。如果尿中含有对氨基酚，那么按本试验条件和方法下，提取完对硝基酚，即旋转蒸发至干步骤时，用少量乙醇溶解后，再用0.01 mol/L盐酸定容至5 ml,直接进样，测出对氨基酚的含量,此时该方法测定的尿中对硝基酚的真实含量应该扣除这一部分。
参考文献
[1] 宣栋梁，黎源倩.高效液相色谱法测定环境水中的酚类化合物［J］.中国公共卫生，2002，18（9）：1102-1104
[2] 姜汉硕，张淑琴.尿中对硝基酚的高效液相色谱测定法［J］.工业卫生与职业病，1992，18（1）：48-50
作者单位：164300 黑龙江省黑河市疾病预防控制中心
【关键词】尿样；应用荧光法；硝基酚
Application of assay in the human body in the urine of the contents of nitro
YUAN Bo
【Abstract】On nitrophenol is similar nitrobenzene of human contact after the body of the main metabolites, urinary concentrations of nitrophenols to the determination was considered the biological monitoring and diagnosis of occupational diseases as an important indicator. We have established a high-performance liquid chromatography (fluorescence) detected in the urine of human nitrophenol the new method. The method is simple, no gradient elution procedures, without pre-column derivatives, high sensitivity, low detection limits, to meet the actual work of a lower level of biological samples.
【Key words】Urine; application of fluorescence; Nitrophenol
近年来，有毒有害化学污染物对生态环境及人体健康的影响已引起人们高度重视〔1〕。对硝基酚是人体接触硝基苯类同系物后体内产生的主要代谢产物，尿中对硝基酚浓度的测定，被认为是生物学监测和职业病诊断的重要指标。尿中对硝基酚的测定方法有高效液相色谱法（紫外检测器）〔2〕及气相色谱法。气相色谱法需将对硝基酚转化成极性极小、挥发度较大的衍生物后再测定，操作复杂，要求较高。高效液相色谱法（紫外检测器）检测限一般为0.30mg/L左右，不适用于检测尿样中微量的对硝基酚。因此，我们建立了高效液相色谱（荧光法）检测人体尿样中对硝基酚的新方法。本方法操作简单，不需程序梯度洗脱，不需柱前衍生，灵敏度高，检出限低，能够满足实际工作中含量较低的生物样品测定。现报告如下：
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂。2690型高效液相色谱仪(HPLC)，附474型荧光检测器（美国Waters公司）；DK-S24型恒温水浴（100℃）；SHZ-III旋转蒸发器(上海精科实业有限公司)；ESJ200-4型电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）；828型酸度计（美国奥立龙公司）。二氯甲烷，分析纯（天津市光复精細化工研究所）；硼氢化钠，分析纯（上海山浦化工有限公司）；盐酸，优级纯（葫芦岛市渤海化学试剂厂）；乙醇，优级纯（天津化学试剂有限公司）；乙腈，色谱纯（山东禹王实业有限公司禹城化工厂）；磷酸二氢钾，分析纯(天津市化学试剂六厂）。
1.2 色谱条件。色谱柱为HYPERSIL C18(ODS)250×4.6 mm；流动相为乙睛：磷酸二氢钾缓冲液=65：35（pH=7）；流量1 ml/min；柱温55℃。
1.3 尿样的采集与保存。用聚乙烯瓶收集尿样，测比重，每100ml滴加3～4滴浓盐酸，贮于4℃冰箱中，可保存14 d。
1.4 实验方法。
1.4.1 标准溶液的配制。对硝基酚标准溶液（1 mg/ml）：称取对硝基酚标准品（美国Sigma公司）0.1000g，先溶于少量乙醇中，再用0.01mol/L盐酸定容至100ml棕色瓶中，摇匀，作为储备液。对氨基酚标准溶液（1mg/ml）：称取对氨基酚标准品（美国Sigma公司）0.1000g，先溶于少量乙醇中，再用0.01mol/L盐酸定容至100ml棕色瓶中，摇匀，作为储备液。
1.4.2 操作方法。取100ml尿液于25ml具塞比色管中，加2ml盐酸，混匀，加盖，置于沸水浴中加热1h；取出，冷却至室温，滤入分液漏斗中，加10ml二氯甲烷，震荡2min，静止分层后，分取有机相，每次用5ml二氯甲烷萃取2次，合并萃取液于旋转蒸发器中，旋转蒸发至干，用5ml乙醇分多次洗涤旋转蒸发瓶，溶液并入25ml比色管中。向比色管中加入0.2g硼氢化钠粉末，再分次加入2.5 ml的2mol/L盐酸溶液，进行还原反应，待反应停止后，先用酸度计调pH至2，再用0.01 mol/L盐酸定容至15 ml刻度，静止5 min。调激发波长和发射波长分别为271和371 nm，以乙腈和磷酸盐缓冲液作为流动相测定。
2 结果
2.1 还原条件的选择。
2.1.1 对氨基酚的荧光激发和发射波长。对硝基酚不发荧光，但可被硼氢化钠还原为发荧光的对氨基酚。经对对氨基酚的标准溶液进行荧光光谱扫描得知，对氨基酚的荧光激发波长和发射波长分别为271和371nm。
2.1.2 溶液酸度对荧光强度的影响 。取10 μg/ml对氨基酚标准溶液，用盐酸和氢氧化钠调节pH值分别为1，2，3，4，5，6。测定每种pH值下色谱峰面积值。结果表明，对氨基酚在pH值为2的盐酸介质中峰面积达最大且稳定。本试验选取pH=2进行测定。
2.1.3 硼氢化钠的用量。固定对硝基酚加入量100μg，加入0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 g不同量的硼氢化钠于比色管中。结果表明，当硼氢化钠用量为0.2 g时，荧光强度最大且稳定。本试验选择0.20 g硼氢化钠进行还原。
2.1.4 还原时酸的用量。固定对硝基酚加入量为100μg，硼氢化钠加入量0.20 g，分别加入0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 ml的2 mol/L盐酸进行实验。结果表明，加入2.5 ml 2 mol/L盐酸时，荧光强度最大，此时测得体系的pH值为1.99。在对硝基酚还原反应中，加入酸主要用于中和还原过程中产生的碱和使体系保持酸性。因此，选择合适的酸用量对于保持反应体系的稳定起重要作用。
2.2 色谱条件的选择：
2.2.1 流动相。在流速为1.0 ml/min条件下，分别试验了甲醇+水、乙腈+水、乙腈+磷酸二氢钾缓冲液（pH=7）几种流动相对对氨基酚的色谱荧光强度的影响。发现乙腈+磷酸二氢钾缓冲液（65：35，V/V）最好，且与其他峰得到了很好的分离。因此，本试验选择乙腈/磷酸二氢钾溶液（65：35，V/V）作为流动相。
2.2.2 检测限。以3倍仪器噪声的峰高相当的值为检测限时，本法的最低检出浓度为0.08 μg/ml。
2.2.3 相对标准偏差。对标准溶液对氨基酚连续进行11次平行测定。色谱峰面积分别为77438，77438，76258，74617，76138，75763，74466，74047，73165，73744，73923；均值为75181.545，标准差为1497.65，相对标准偏差(RSD)为1.99%。
2.3 尿中对硝基酚的测定。2005年松花江水受到硝基苯污染后，分别用高效液相色谱荧光法和高效液相色谱紫外检测法〔2〕对受污染地区人群尿样中对硝基酚含量进行了监测分析。同一样本在对硝基酚含量较高时，2种方法的结果一致，而在对硝基酚含量较低时，由于HPLC（紫外检测器）的检测限（0.31 μg/ml）较高而无法检测出真实的结果，而本方法因检测限（0.08 μg/ml）较低则较好地完成了检测分析，表明本研究适用于接触硝基苯及其同系物的人员尿中微量代谢产物对硝基酚的测定。
3 讨论
硝基苯及含有对硝基苯基的化合物进入人体后，主要代谢物为对硝基酚，但亦有少量对氨基酚共存于尿中。如果尿中含有对氨基酚，那么按本试验条件和方法下，提取完对硝基酚，即旋转蒸发至干步骤时，用少量乙醇溶解后，再用0.01 mol/L盐酸定容至5 ml,直接进样，测出对氨基酚的含量,此时该方法测定的尿中对硝基酚的真实含量应该扣除这一部分。
参考文献
[1] 宣栋梁，黎源倩.高效液相色谱法测定环境水中的酚类化合物［J］.中国公共卫生，2002，18（9）：1102-1104
[2] 姜汉硕，张淑琴.尿中对硝基酚的高效液相色谱测定法［J］.工业卫生与职业病，1992，18（1）：48-50
作者单位：164300 黑龙江省黑河市疾病预防控制中心